本發明專利技術公開了一種用于鑒別四倍體大燕麥、普通小麥或其雜交后代染色體數的制片方法，包括預處理、固定、酶解、酸解、后低滲、后固定、制片、染色以及壓片等步驟。本發明專利技術通過對常規方法進行改進，得到了一種能夠有效鑒別四倍體大燕麥、普通小麥或其雜交后代染色體數的制片方法，實驗證明采用該方法得到的制片中細胞分裂相多、染色體分散好，而且重復性高，結果可靠。因此，本發明專利技術為鑒別四倍體大燕麥、普通小麥或其雜交后代染色體的數目提供了一種新的方法，也為大燕麥與普通小麥的雜交和選育工作提供了技術支持。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種植物染色體的制片方法，特別涉及一種有效鑒別四倍體大燕麥、普通小麥或其雜交后代染色體數的制片方法，本專利技術屬于生物
技術介紹
四倍體大燕麥(AvenamagnaL.)是一個野生種,系異源四倍體，表現為對小麥白粉病、銹病、赤霉病高抗或免疫，以及具有早熟、抗旱，蛋白質(42％)、賴氨酸含量高等特點(孫澤民等.中國燕麥.北京:中國農業出版社,1989；余懋群等.3種燕麥的核型研究.武漢植物學研究,1995,13(2):177-179；鄧光兵等.燕麥種間雜種F1的形態學與細胞遺傳學研究.作物學報,2005,31(9):1186-1191.)。為了使四倍體大燕麥的這些優良性狀轉移到普通小麥(TriticumaestivumL.)，最近十多年來，本課題組開展了一系列四倍體大燕麥與普通小麥的雜交和選育工作，獲得了一批品質好的、穩定的雜交品系。有效了解這些雜交后代的染色體組成對于認識其雜交和染色體重組機制具有重要的作用。植物染色體的制備有上百年的歷史，使用的部位包括根尖、腋芽、莖尖、愈傷組織等生長旺盛的區域。小麥為世界范圍內重要的糧食作物，因此人們很早就關注其染色體組成并做了大量的觀察分析，流程大體如下(陳瑞陽等：植物有絲分裂染色體標本制備新方法.植物學報,1979,21(3):297-298；李懋學，張敩方.植物染色體研究技術.哈爾濱：東北林業大學出版社.)：1.預處理：應用適宜的預處理液(如飽和的α-溴代奈、對苯二酚、一定濃度的8-羥基喹啉或秋水仙素溶液)或低溫等。2.低滲：通常用蒸餾水或0.075MKCl室溫處理30分鐘。3.固定：最常用固定液為甲醇：冰醋酸(體積比3：1)。4.解離：一種是酸解，酸解液為1N的濃鹽酸或濃鹽酸：95％乙醇(體積比1：1)；一種是酶解，即一定濃度的纖維素酶和果膠酶混合液。5.后固定：解離后的材料水洗后用上述固定液固定。6.制片：大多采用壓片法或火焰干燥法。7.染色：染色液有改良的苯酚品紅、卡寶品紅、孚爾根、吉姆薩等。迄今國內有關燕麥染色體制備方面的報道很少，步驟也不很詳細。武生輝等(武生輝等.野生大燕麥和砂燕麥的核型研究.內蒙古農牧學院學報,1989,10(2):115-120.)開展野生大燕麥和砂燕麥染色體制備的流程為：預處理--0.002M8-羥基喹啉的0.01％-0.2％秋水仙素溶液，3小時；酸解--1NHCl，60℃下，5-8分鐘；水洗--蒸餾水沖洗3-5次或沖洗1-2次后用水泡1小時；酶解--2.5％果膠酶和纖維素酶混合液，26℃，40分鐘；染色--卡寶品紅，5-20分鐘。余懋群等(余懋群等.3種燕麥的核型研究.武漢植物學研究,1995,13(2):177-179.)提供的砂燕麥、野生大燕麥、黑龍江野燕麥核型分析的步驟很簡單，即：取萌發種子的根尖，在飽和α-溴代奈溶液0-4℃下預處理1夜后，用酒精、冰醋酸(3：1)固定液0-4℃下固定24小時，用孚爾根染色觀察。綜上所述，到目前為止有關普通小麥和燕麥染色體制備的方法不外乎預處理、固定、解離、后固定、制片和染色等程序。為了探討四倍體大燕麥與普通小麥雜交后代染色體的數目，我們最初也采用這種通用的技術處理根尖，然而結果并不理想，表現在：第一，采用研究者們普遍使用的飽和α-溴代奈室溫預處理3小時或用蒸餾水4℃低溫過夜處理后，根尖細胞中的分裂相較少，染色體黏在一起，難以鑒別。而不經任何預處理后直接低滲、固定，根尖細胞中的分裂相較多，但染色體分散差。第二，用蒸餾水或0.075MKCl室溫前低滲處理30分鐘達不到使染色體分散的效果。第三，只用酶解或酸解難以使根尖有效軟化、缺少后低滲、后固定的時間短于1小時、壓片力度不足等，這些都影響到細胞的分散和染色體的分開。因此，目前迫切需要提供一種可用于普通小麥和大燕麥染色體制備的方法，從而為大燕麥與普通小麥的雜交和選育工作提供技術支持。
技術實現思路
針對現有技術中存在的問題，考慮到這兩個親緣關系較近的物種雜交后會發生染色體斷裂、融合、易位等現象，從而導致細胞內染色體很粘稠，不易分開的特點，本專利技術人認為：恰當的預處理是必要的，但濃度需要調整；前低滲的時間需要延長；酶解和酸解應該合理結合從而保證植物材料能充分軟化；增加后低滲以及后固定處理的時間。為此，本專利技術提出了一種用于鑒別四倍體大燕麥、普通小麥或其雜交后代染色體數的制片方法，具體步驟如下：(1)預處理：0.075mol/LKCl溶液、飽和α-溴代萘溶液和蒸餾水按照體積比2：3：5配制成預處理液，將植物材料浸泡于預處理液中，22-25℃處理3小時后，水洗15分鐘；(2)固定：甲醇與冰醋酸按照體積比3：1配制成固定液，將預處理后的植物材料用固定液固定，22-25℃固定1小時，水洗15分鐘；(3)酶解：2％纖維素酶和2％果膠酶按照體積比1:1配制成酶解液，將固定后的植物材料用酶解液在37℃下酶解2小時，快速水洗，避免劇烈震蕩；(4)酸解：濃鹽酸和95％乙醇按照體積比1：1配制成酸解液，將酶解后的植物材料用酸解液22-25℃處理1分鐘，水洗15分鐘；(5)后低滲：酸解后的植物材料置于0.075mol/LKCl溶液中，22-25℃處理1小時；(6)后固定：經后低滲處理后的植物材料采用步驟(2)中的固定液22-25℃固定1小時以上；(7)制片：挑取2-3個經上述步驟處理后的植物材料，用玻棒用力砸碎后輕輕鋪散到整個載玻片，而后進行火焰干燥；(8)染色；(9)壓片。在本專利技術中，優選的，所述的植物材料包括取自四倍體大燕麥、普通小麥或其雜交后代的根尖或莖尖。在本專利技術中，優選的，所述的染色包括在載玻片上滴加改良苯酚品紅，加上蓋片，22-25℃染色10分鐘。采用本專利技術的方法，我們對四倍體大燕麥與普通小麥雜交后代22個品系的染色體數目進行了分析，結果發現采用該方法得到的染色體制片中細胞分裂相多、染色體分散好，而且該方法重復性高，結果可靠，因此，本專利技術提供了一種能夠有效鑒別四倍體大燕麥、普通小麥或其雜交后代染色體的數目新方法。附圖說明圖1為采用常規制片方法觀察到的細胞分裂相照片；圖1A為雜交后代品種S20的細胞分裂相照片(x200)，其中很難找到一個中期相；圖1B為雜交后代品種S109-3-5的細胞分裂相照片(x200)，其中未見一個中期相；圖2為采用常規制片方法觀察到的染色體的分散情況；圖2A為雜交后代品種S109-169的染色體的分散情況(x1000)，其中大部分染色本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種用于鑒別四倍體大燕麥、普通小麥或其雜交后代染色體數的制片方法，其特征在于包括以下步驟：(1)預處理：0.075mol/L?KCl溶液、飽和α?溴代萘溶液和蒸餾水按照體積比2：3：5配制成預處理液，將植物材料浸泡于預處理液中，22?25℃處理3小時后，水洗15分鐘；(2)固定：甲醇與冰醋酸按照體積比3：1配制成固定液，將預處理后的植物材料用固定液固定，22?25℃固定1小時，水洗15分鐘；(3)酶解：2％纖維素酶和2％果膠酶按照體積比1:1配制成酶解液，將固定后的植物材料用酶解液在37℃下酶解2小時，快速水洗，避免劇烈震蕩；(4)酸解：濃鹽酸和95％乙醇按照體積比1：1配制成酸解液，將酶解后的植物材料用酸解液22?25℃處理1分鐘，水洗15分鐘；(5)后低滲：酸解后的植物材料置于0.075mol/L?KCl溶液中，22?25℃處理1小時；(6)后固定：經后低滲處理后的植物材料用步驟(2)中的固定液22?25℃固定1小時以上；(7)制片：挑取2?3個經上述步驟處理后的植物材料，用玻棒用力砸碎后輕輕鋪散到整個載玻片，而后進行火焰干燥；(8)染色；(9)壓片。
【技術特征摘要】
1.一種用于鑒別四倍體大燕麥、普通小麥或其雜交后代染色體數的制片方法，其特征
在于包括以下步驟：
(1)預處理：0.075mol/LKCl溶液、飽和α-溴代萘溶液和蒸餾水按照體積比2：3：5配制
成預處理液，將植物材料浸泡于預處理液中，22-25℃處理3小時后，水洗15分鐘；
(2)固定：甲醇與冰醋酸按照體積比3：1配制成固定液，將預處理后的植物材料用固定
液固定，22-25℃固定1小時，水洗15分鐘；
(3)酶解：2％纖維素酶和2％果膠酶按照體積比1:1配制成酶解液，將固定后的植物材
料用酶解液在37℃下酶解2小時，快速水洗，避免劇烈震蕩；
(4)酸解：濃鹽酸和95％乙醇按照體積比1：1配制成酸解液，將酶解后的植物材料用酸...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張飛雄，楊才，趙云云，史文碩，張彩云，許夢月，馬克世，
申請(專利權)人：首都師范大學，
類型：發明
國別省市：北京;11
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