一種固定化蛋白的方法技術

本發明專利技術涉及一種用于固定蛋白的方法。本發明專利技術還涉及一種用于固定蛋白的化合物。所述化合物具有氟磺酰基，能夠特異性地且共價地在酪氨酸殘基處來標記蛋白。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種用于固定蛋白的化合物以及一種用于固定蛋白的方法。
技術介紹
將蛋白固定到如微陣列、芯片和珠等固體載體上是一種用于闡明蛋白-蛋白或蛋白-配體相互作用以及用于以高處理量的方式探測新蛋白功能的強大方法。不同于DNA微陣列的情況，由于在實現將蛋白選擇性地且均勻取向地分布到固體表面中的固有困難，實施用于蛋白固定的通用方法存在著挑戰。常規固定方法主要依賴三種機理：物理連接、共價鍵合和生物親和性固定。然而非選擇性的物理連接或共價鍵合可能阻塞活性部位或甚至使蛋白變性。通過重組融合標簽和所偶聯蛋白的共表達進行固定可以相應保證蛋白的確切取向并且提供了微調生物結合物拓撲結構的靈活性。例如，將sjGST標簽固定到GSH-結合的聚合物珠或將His-標簽固定到Ni-NTA芯片或將生物素-標簽結合到鏈霉親和素涂布的固體載體上已經被廣泛地選作非共價蛋白固定方法用于保持所標簽蛋白的活性。因此開發一種有效且穩定的固定蛋白的策略，能夠最大限度地保持活性，是有著顯著意義和應用價值。位置選擇性共價固定蛋白最近引起很多關注，因為它能夠穩定地、均勻地且高密度地固定各種蛋白。其方法是將所關注的蛋白與標簽蛋白共表達，再利用后者與其被固定的底物分子共價地且選擇性地反應。比如，Kindermann等報道了一種通過不可逆地將O6-芐基鳥嘌呤衍生物的烷基連接到hAGT半胱氨酸殘基之一來固定hAGT-標簽的共價方法。GST-標簽蛋白具有高底物親合性，然而，已知的GST標簽固定方法仍然基于可逆的GSH-GST結合，限制了它們的應用。Viswanathan等報道了通過銅(I)-催化的Huisgen[3+2]環加成反應(“click”反應)將在C-末端半胱氨酸殘基上，用炔改性的GST蛋白共價固定到玻璃表面上的策略。盡管實現了共價和定向結合，但是銅催化劑可引起某些不穩定的蛋白的變性或沉淀，因此有可能在固定后降低了蛋白活性。另外，相比于傳統的GSH-GST方法，將炔基團引入GST蛋白是耗時的且高成本的。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一類小分子物質，其能夠通過位置選擇性共價鍵合的方式共價固定蛋白，特別是sjGST-標簽化的蛋白。本專利技術的目的還在于提供一類能夠以相對簡單的方法合成的具有氟磺酰基的小分子，當用它們處理sjGST-標簽化的蛋白時能夠共價地、選擇性地、不可逆地標記sjGST。具體來說，本專利技術提供了下述技術方案：技術方案1.式I的化合物：其中，R1是苯基的任選取代基；R2是Ar的任選取代基；m是0、1、2、3、4；n是0、1、2、3、4；連接基團是任選被取代的，并且是由下述A組中的0-15個和下述B組中的一個組成的三價基團，A組：─O─、─NH─、─S─、─SO─、─SO2─、─CO─、─C(═NH)─、─C(═S)─、─C(═SO)─、─C(═SO2)─、─C1-10亞烷基─、─C3-10亞環烷基─、與─(3-10)元亞雜環烷基─，B組：─N═、─C1-10次烷基═、─C3-10次環烷基═、與─(3-10)元次雜環烷基═；Ar是苯、萘、單環雜芳基、雙環雜芳基；R選自：可與固體表面反應的基團，包括但不限于氨基(NH2)，羥基(OH)，巰基(SH)，羧基(COOH)；熒光團(fluorophore)；生物素部分；-C0-10亞烷基-C≡CH；和氫。技術方案2：根據上述技術方案中任一個的化合物，其中所述式I是下述式II：技術方案3：根據上述技術方案中任一個的化合物，其中所述連接基團選自：技術方案4：根據上述技術方案中任一個的化合物，其中所述-Ar-(R2)n是技術方案5：選自下列的化合物：技術方案6.一種固定蛋白的方法，包括下述步驟：步驟1：通過共價或非共價相互作用，將權利要求1-N中任一項的化合物接枝到固體表面；和步驟2：通過在酪氨酸殘基的共價鍵，將蛋白固定到步驟1中制備的固體表面上；或者步驟1：通過在酪氨酸殘基的共價鍵，使權利要求1-N中任一項的化合物與蛋白反應；和步驟2：通過共價或非共價相互作用，將步驟1中制備的蛋白接枝到固體表面。技術方案7：根據技術方案6的方法，其中所述固體表面包括金屬、聚合物或納米材料的表面。技術方案8：根據技術方案6或7的方法，其中所述共價或非共價相互作用包括生物素-鏈霉親和素相互作用或抗原-抗體相互作用。技術方案9：根據技術方案6、7或8的方法，其中所述酪氨酸殘基是日本血吸蟲谷胱甘膚S-轉移酶的酪氨酸-111殘基。附圖說明圖1：通過融合的GST標簽蛋白的位置選擇性共價固定，其中sjGST，PDBID：1M9A。圖2：(A)G1-H和G1-炔的化學結構；(B)重組sjGST蛋白的G1-炔標記(每個條帶0.5μg)：熒光掃描(FL，上部)；考馬斯藍著色(CBB，下部)；(C)在(B)中的熒光帶的密度測定。圖3：添加不同濃度的G1-H的競爭試驗：(A)在G1-炔處理前和(B)在G1-炔處理后(sjGST，每個條帶0.5μg)。圖4：MALDI-TOF-MS顯示酪氨酸-111作為G1化合物的結合位點。(A)在胰蛋白酶消化后在G1-H和G1-炔處理的sjGST肽之間檢測出52道爾頓的質量偏移。(B)MS/MS分析，在1093和1145處的峰。(C)Y111FsjGST突變體消滅了G1-炔所造成的標記。圖5：(A)G1-生物素的化學結構。(B)在G1-生物素預處理的、鏈霉親和素-涂布的96-孔微板上的GST-eGFP固定。(C)用漸增量的G1-生物素捕獲GST-eGFP的結果(更多GST-eGFP被捕獲)。(D)用漸增量的G1-H預培養GST-eGFP逐漸使固定減弱。圖6：(A)G1-H固定的瓊脂糖凝膠珠的結構。(B)和(C)可溶性(青色，位置靠上)和固定的(綠色，位置靠下)激酶ITK和EGFR的基于HTRF的酶活性實驗結果。具體實施方案縮略語：ACN乙腈ATP三磷酸腺苷Beads珠/高分子球Biotin生物素Boc叔丁基氧羰基DCM二氯甲烷DEAD偶氮二甲酸二乙酯DMF二甲基甲酰胺DMSO二甲基亞砜EDTA乙二胺四乙酸eGFP增強綠色熒光蛋白EGFR表皮生長因子受體G1-AlkyneG1-炔G1-biotinG1-生物素GFP綠色熒光蛋白GSH谷胱甘肽GST谷胱甘膚S-轉移酶1-[雙(二甲基氨基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓HATU3-氧化物六氟磷酸鹽,1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium3-oxidhexafluorophosphateHEP本文檔來自技高網...

【技術保護點】
式I的化合物：其中，R1是苯基的任選取代基，選自鹵素，NH2?、CN?，OH?，HS?，?NO2，?CF3，?COOH，CH3CO?，(C1?10烷基)?COO?，?O?C1?10烷基，C1?10烷基?、C2?10烯基?、C2?10炔基?、單環或雙環的C3?10環烷基?、芳基?、芳基?O?芳基?、5或6元含1?4個選自O、N和S的雜芳基、(5或6元含1?4個選自O、N和S的雜芳基)?O?(5或6元含1?4個選自O、N和S的雜芳基)?、(5或6元含1?4個選自O、N和S的雜芳基)?O?芳基?、和芳基?O?(5或6元含1?4個選自O、N和S的雜芳基)?；R2是Ar的任選取代基，選自鹵素，NH2?、CN?，OH?，HS?，?NO2，?CF3，?COOH，CH3CO?，(C1?10烷基)?COO?，?O?C1?10烷基，C1?10烷基?、C2?10烯基?、C2?10炔基?、單環或雙環的C3?10環烷基?、芳基?、芳基?O?芳基?、5或6元含1?4個選自O、N和S的雜芳基、(5或6元含1?4個選自O、N和S的雜芳基)?O?(5或6元含1?4個選自O、N和S的雜芳基)?、(5或6元含1?4個選自O、N和S的雜芳基)?O?芳基?、和芳基?O?(5或6元含1?4個選自O、N和S的雜芳基)?；m是0、1、2、3、4；n是0、1、2、3、4；連接基團是任選被取代的，并且是由下述A組中的0?15個和下述B組中的一個組成的三價基團，A組：─O─、─NH─、─S─、─SO─、─SO2─、─CO─、─C(═NH)─、─C(═S)─、─C(═SO)─、─C(═SO2)─、─C1?10亞烷基─、─C3?10亞環烷基─、與─(3?10)元亞雜環烷基─，B組：─N═、─C1?10次烷基═、─C3?10次環烷基═、與─(3?10)元次雜環烷基═；Ar是苯、萘、單環雜芳基、雙環雜芳基；R選自：可與固體表面反應的基團；熒光團(fluorophore)；生物素部分；?C0?10亞烷基?C≡CH；和氫。...

【技術特征摘要】
1.式I的化合物：
其中，
R1是苯基的任選取代基，選自鹵素，NH2-、CN-，OH-，HS-，-NO2，
-CF3，-COOH，CH3CO-，(C1-10烷基)-COO-，-O-C1-10烷基，C1-10烷基-、
C2-10烯基-、C2-10炔基-、單環或雙環的C3-10環烷基-、芳基-、芳基-O-芳基
-、5或6元含1-4個選自O、N和S的雜芳基、(5或6元含1-4個選自O、
N和S的雜芳基)-O-(5或6元含1-4個選自O、N和S的雜芳基)-、(5或
6元含1-4個選自O、N和S的雜芳基)-O-芳基-、和芳基-O-(5或6元含
1-4個選自O、N和S的雜芳基)-；
R2是Ar的任選取代基，選自鹵素，NH2-、CN-，OH-，HS-，-NO2，
-CF3，-COOH，CH3CO-，(C1-10烷基)-COO-，-O-C1-10烷基，C1-10烷基-、
C2-10烯基-、C2-10炔基-、單環或雙環的C3-10環烷基-、芳基-、芳基-O-芳基
-、5或6元含1-4個選自O、N和S的雜芳基、(5或6元含1-4個選自O、
N和S的雜芳基)-O-(5或6元含1-4個選自O、N和S的雜芳基)-、(5或
6元含1-4個選自O、N和S的雜芳基)-O-芳基-、和芳基-O-(5或6元含
1-4個選自O、N和S的雜芳基)-；
m是0、1、2、3、4；
n是0、1、2、3、4；
連接基團是任選被取代的，并且是由下述A組中的0-15個和下述B
組中的一個組成的三價基團，
A組：─O─、─NH─、─S─、─SO─、─SO...

【專利技術屬性】
技術研發人員：潘崢嬰，郭天林，周怡青，
申請(專利權)人：北京大學深圳研究生院，
類型：發明
國別省市：廣東;44