用于定量和/或半定量突變檢測方法的組合物技術

本發明專利技術涉及可以用作定量和/或半定量檢測方法，具體地，數字PCR或下一代測序測定的對照和/或參考的組合物。本發明專利技術還描述了合成核酸構建體，具體地，存在于所述組合物中的質粒、試劑盒、它們的用途以及涉及根據本發明專利技術所述的組合物的用途的方法。此外，本文描述了用于提供根據本發明專利技術所述的組合物的方法。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及可以用作定量和/或半定量突變檢測方法，具體地，數字PCR或下一代測序方法的對照和/或參考的組合物。本專利技術還描述了合成核酸構建體，具體地，存在于所述組合物中的質粒、包含所述組合物的試劑盒、它們的用途以及涉及使用根據本專利技術所述的組合物的方法。此外，本文描述了用于提供根據本專利技術所述的組合物的方法。
技術介紹
核酸序列的使用已成為現代醫學的多種診斷領域中的必需工具。具體地，基于下一代測序(NGS)的基因測試正迅速在臨床診斷學中獲得認可。該領域的實例為腫瘤學，其中使用核酸測序來鑒定(例如)致癌突變是否存在于基因中或者引起和/或指明癌癥的移位是否存在于基因組中。此外，使用核酸測序來檢測病原微生物(如，例如，細菌或病毒)是否存在于來自人患者的臨床樣品，例如，組織樣品或血液樣品中。在后一種方法中，檢測不存在于人受試者中，而僅存在于微生物中的核酸序列。因此，NGS方法可以導致靶標序列的鑒定和序列確定，其可以表明致癌突變的存在或不存在或者病原體-來源的核酸的存在或不存在。因此，目前開發了用于診斷目的的基于NGS技術及其它定量和/或半定量突變檢測方法的診斷試劑盒和/或方法。然而，由于管理性規定，在許多國家，在實際產品許可進入市場之前，必須顯示這類診斷試劑盒和方法的準確度和有用性(例如，通過達到特定靈敏度閾值)。在該背景下，通常需要顯示所使用的方法適合檢測稀有突變或稀有核酸，例如，以5％或以下的頻率在臨床樣品中發生的突變或核酸。另外，為了確保已正確進行診斷方法，由此避免任何假陰性結果，還必須提供具有如通常在臨床樣品中處于類似的低頻率的待檢測的突變或核酸的陽性對照。然而，對于稀有突變(如在某些類型癌癥中存在的突變)或對于以低百分比存在于樣品中的核酸(例如，來源于病原體的核酸)，很難獲得可以用作測試材料的攜帶處于所需頻率的待檢測的突變和/或核酸的臨床樣品。因此，需要包含處于所需頻率的待檢測的稀有突變和/或核酸的參考組合物和/或對照組合物。
技術實現思路
因此，本專利技術的目標是提供這種參考和/或對照組合物。在本專利技術的背景中，現已意外地發現組合物以限定的摩爾比包含(i)合成核酸構建體，具體地，包含至少一種插入的野生型核酸序列的質粒或(ii)基因組DNA和(iii)合成核酸構建體，具體地，包含至少一種插入的靶標核酸序列的質粒，所述組合物可以用作用于半定量和/或定量方法(如NGS或數字PCR)的這種參考和/或對照組合物。通過使用本專利技術所述的組合物，不再需要使用可能難以獲得并且其中所存在的待檢測的突變或核酸的頻率可能不同的臨床樣品。此外，本專利技術所述的組合物提供了以下優勢：可以提供它們用于任何所需的待檢測突變或核酸或待檢測突變或核酸的組合以及用于任何所需百分比的待檢測突變或核酸。在以下說明中，提及了存在于根據本專利技術所述的組合物中的質粒(i)和(iii)。然而，應理解當然在本專利技術的背景中還可以使用能夠包含野生型靶標序列或其突變體或者任何其它序列(如來源于病原體的序列)中任一種的任何其它合成核酸構建體。因此，在一個方面，本專利技術涉及組合物，其包含：(i)含有至少一種插入的野生型核酸序列的質粒，或(ii)野生型基因組DNA序列，與限定的摩爾比的(iii)含有至少一個插入的靶標核酸序列的質粒。一個實施方式涉及所述組合物，其中所述質粒(iii)包含1-50個插入的靶標核酸序列。在另一個實施方式中，質粒(iii)包含1-30個插入的靶標核酸序列。在其它實施方式中，質粒(iii)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個插入的靶標核酸序列。在另一個實施方式中，(iii)和(i)或(ii)的限定的摩爾比在1:10-1:30的范圍內，任選地，(iii)和(i)或(ii)的限定的摩爾比為1：15至1:25，例如，1:20、1:18，任選地，1:19。在另一個實施方式中，所述組合物為用于定量和/或半定量突變檢測方法的陽性對照組合物或參考組合物。在一個實施方式中，所述定量和/或半定量突變檢測方法為數字PCR和/或下一代測序(NGS)。本專利技術的另一個方面涉及在定量和/或半定量突變檢測方法中如本文所述的組合物作為對照組合物和/或參考組合物的使用。在一個實施方式中，將所述組合物用作陽性對照組合物。在另一個方面，將所述組合物用于測試定量和/或半定量突變檢測方法的靈敏度。在另一個實施方式中，將確認對于平均以10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％或3％存在于樣品中的一個或多個靶標序列的靈敏度。在其它實施方式中，所述突變檢測方法為數字PCR和/或下一代測序(NGS)。在另一個實施方式中，所述定量和/或半定量突變檢測方法用于來源于病原體或致癌基因的序列的存在與否的檢測。本專利技術的其它方面涉及確認半定量和/或定量檢測方法對于一個或多個靶標序列的靈敏度的方法，其包括以下步驟：(i)提供如本文所述的組合物，(ii)使用所述組合物實施所述半定量和/或定量檢測方法，和(iii)評價所述檢測方法的靈敏度。本專利技術的另一個方面涉及制備如本文所述的組合物的方法，其中所述方法包括以下步驟：(i)將野生型序列引入到質粒中或提供野生型基因組DNA(gDNA)，(ii)將至少一個靶標序列引入到單獨的質粒中，(iii)所述質粒和/或gDNA的絕對定量(iv)以限定的摩爾比制備(i)和(ii)的組合物。在用于制備如本文所述的組合物的方法的一個實施方式中，通過數字PCR(dPCR)，任選地通過數字微滴式PCR(ddPCR)進行所述質粒或gDNA的絕對定量。本專利技術的另一個方面涉及包含如本文所述的組合物的試劑盒。附圖說明圖1顯示了制備作為如以下所述的實施例中所使用的NGS測定的測試材料的質粒組合物的列表。定義除非上下文中明確規定，否則如本說明書和權利要求中所使用的，單數形式的“一個”也包括相應的復數形式。反之亦然，當使用名詞的復數形式時，除非上下文明確表明，否則它還表示單數形式。例如，當提及復數的突變時，還理解為涉及單個突變。需要理解術語“包括”不是限制性的。出于本專利技術的目的，術語“由…組成”應認為是術語“包括”的優選實施方式。如果在下文中將組定義為包括至少某些實施方式，則這還意味著涵蓋了優選地僅由這些實施方式組成的組。此外，說明書和權利要求中的術語第一、第二、第三或(i)、(ii)、(iii)等用于區別類似的元素并且不必須用于描述順序或依時間次序。應理解在適當的情況下，如此使用的術語是可互換的，并且本文所述的本專利技術的實施方式能夠以本文所述或所示的順序以外的順序進行。然而，在本專利技術的具體實施方式中，依時間次序進行方法步驟(i)、(ii)和(iii)，其任選地包括本文定義的任何中間步驟。在本專利技術的背景中，所表示的任何數值通常與本領域技術人員將理解的仍確保所討論的特征的技術效果的準確度間隔有關。如本文所使用的，與所示數值的偏差在±10％的范圍內，并且優選地，±5％的范圍內。還通過本文所使用的術語“約”和“大約”相對于數值表明了上述與所示±10％，并且優選地±5％的數值間隔的偏差。在本專利技術的背景中，術語“核酸”是指處于單鏈或雙鏈形式的天本文檔來自技高網...

【技術保護點】
組合物，其包含：(i)包含至少一種插入的野生型核酸序列的合成核酸構建體，任選是質粒，其，或(ii)野生型基因組DNA序列與限定的摩爾比的(iii)包含至少一種插入的靶標核酸序列的合成核酸構建體，任選地，質粒。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2014.06.30 GB 1411603.21.組合物，其包含：(i)包含至少一種插入的野生型核酸序列的合成核酸構建體，任選是質粒，其，或(ii)野生型基因組DNA序列與限定的摩爾比的(iii)包含至少一種插入的靶標核酸序列的合成核酸構建體，任選地，質粒。2.根據權利要求1所述的組合物，其中所述合成核酸構建體，任選地質粒(iii)包含1-50個插入的靶標序列，任選地合成核酸構建體，任選地質粒(iii)包含1-30個插入的靶標序列。3.根據權利要求1或2所述的組合物，其中所述合成核酸構建體，任選地質粒(iii)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個插入的靶標序列。4.根據以上權利要求中任一項所述的組合物，其中(iii)與(i)或(ii)限定的摩爾比在1:10-1:30的范圍內，任選地(iii)與(i)或(ii)的摩爾比為1:19。5.根據以上權利要求中任一項所述的組合物，其中所述組合物為用于定量和/或半定量突變檢測方法的陽性對照組合物或參考組合物。6.根據權利要求5所述的組合物，其中所述定量和/或半定量突變檢測方法為數字PCR和/或下一代測序(NGS)。7.根據以上權利要求中任一項所述的組合物在定量和/或半定量突變檢測方法中作為對照組合物和/或作為參考組合物的用途，任選地...

【專利技術屬性】
技術研發人員：吳夢楚，阿西尼·史密諾夫，
申請(專利權)人：貝拉醫療新加坡私人貿易有限公司，
類型：發明
國別省市：新加坡;SG