一種血液EGFR基因T790M突變的檢測方法技術

本發明專利技術屬于生物醫學技術領域，具體地說是一種血液EGFR基因T790M突變的檢測方法，包括以下步驟：1)提供引物及探針；2)從待測樣本中提取DNA模板；3)配制熒光PCR擴增突變基因序列的反應體系；4)將步驟2)提取的DNA模板加到步驟3)所得的PCR反應體系中，用步驟1)提供的引物擴增待測的基因序列，用步驟1)提供的探針所擴增的產物雜交，并檢測反應體系的熒光基團的熒光信號，根據熒光信號結果分析，判斷樣本是否存在突變以及突變的比例；本發明專利技術同現有技術相比，靈敏度高，檢測速度快，能夠適用于高通量的樣本檢測，且檢測結果可實時觀察，產物不需要凝膠電泳檢測，完全閉管操作，有效地降低了PCR產物污染的風險。

【技術實現步驟摘要】
一種血液EGFR基因T790M突變的檢測方法[
]本專利技術屬于生物醫學
，具體地說是一種血液EGFR基因T790M突變的檢測方法。[
技術介紹
]近年來，表皮生長因子受體.酪氨酸激酶抑制劑(epidermalgrowthfactorreceptor-tyrosinekinaseinhibitors，EGFR—TKIs)等靶向藥物已經成為晚期非小細胞肺癌(NSCLC)重要的治療方式之一。EGFR是一種跨膜酪氨酸激酶受體，該受體激酶域的激活對癌細胞增殖、生長的相關信號傳遞具有重要意義。通過對患者EGFR基因的突變檢測，可輔助臨床醫生篩選可受益于分子靶向抗腫瘤藥物如易瑞沙、特羅凱和凱美納等的腫瘤患者。但是，隨著其在臨床上的廣泛應用，耐藥問題日益突出。其中，EGFR-T790M突變約占臨床耐藥病人的60％以上。因此，對T790M的檢測十分必要。臨床上大都采用病理組織標本提取DNA進行EGFR檢測，但晚期肺癌病人有時無法獲取腫瘤標本。很多權威研究認為腫瘤組織存在異質性，腫瘤組織不同部位的體細胞基因突變譜并不相同，血清或血漿腫瘤基因突變檢測方便在不同時間點獲取樣本，沒有空間抽樣偏差，已逐漸在臨床上推廣應用。研究顯示，大部分(并非全部)晚期NSCLC患者的血液中存在循環游離DNA(cfDNA，cellfreeDNA)。cfDNA主要來源于凋亡或壞死的細胞，包括正常細胞和腫瘤細胞，如果來自腫瘤細胞稱為循環腫瘤DNA(ctDNA)。但是血液游離DNA片段通常較短，在晚期癌癥患者血液中濃度極低，平均約為17μg/L。因此，對檢測敏感性的要求非常高。目前已有很多血液EGFR基因突變檢測的方法的報道，如高分辨熔點曲線分析法(HRM)、變性高效液相色譜技術(DHPLC)、二代測序、數字PCR方法等。數字PCR在血漿EGFR基因突變檢測上具有較高的靈敏度和特異度，但目前報道的該方法檢測EGFR基因突變位點相對有限(19外顯子缺失，21號外顯子L858R突變以及20號外顯子T790M突變)，仍處在摸索、累積經驗階段；其對操作人員和環境均有較高的要求。而以二代測序技術(NGS)為代表的新技術拓展了基因突變檢測的深度和廣度，但其臨床轉化應用需要更多的數據積累。[
技術實現思路
]本專利技術的目的就是要解決上述的不足而提供一種血液EGFR基因T790M突變的檢測方法，該檢測方法靈敏度高，檢測速度快，能夠適用于高通量的樣本檢測，且有效地降低了PCR產物污染的風險。為實現上述目的設計一種血液EGFR基因T790M突變的檢測方法，包括以下步驟：1)提供引物及探針；2)從待測樣本中提取DNA模板；3)配制熒光PCR擴增突變基因序列的反應體系；4)將步驟2)提取的DNA模板加到步驟3)所得的PCR反應體系中，用步驟1)提供的引物擴增待測的基因序列，用步驟1)提供的探針所擴增的產物雜交，并檢測反應體系的熒光基團的熒光信號，根據熒光信號結果分析，判斷樣本是否存在突變以及突變的比例。進一步地，步驟1)中，引物及探針為：上游引物：5’-CCGAAGGGCATGAGCTGCG-3’；下游引物：5’-TCCAGGAAGCCTACGTGATC-3’；探針：FAM-CGGTGGAGGTGAGGCAGATC-BHQ1。進一步地，步驟2)中，待測樣本為血漿游離DNA。進一步地，步驟3)中，PCR反應體系包括酶、dNTP、PCR緩沖液、引物、探針。進一步地，步驟3)中，PCR反應體系的反應液成分及用量為：成分用量10*Buffer250ul25mMMgCl2150ul25mMAGCU10ul25mMdTTP1.25ul上游引物5ul下游引物5ul目標探針7.5ulH2O696.25ul其中，10*buffer以1ml體系計，其配方為：1MTris100ul、1MKCl500ul、Triton/Tween10ul/5ul原液、TE390ul/395ul。進一步地，步驟4)中，PCR擴增與信號收集程序如下：第一階段：94℃，2分鐘；第二階段：94℃，20秒，40個循環；第三階段：55℃，10秒，40個循環；第四階段：65℃，1分鐘，40個循環；信號收集：第四階段65℃時收集FAM和VIC信號。進一步地，步驟4)中，若待檢樣本DNA的外控CT值>30，提示樣本DNA濃度過低或降解嚴重，則需更換樣本或重新提取DNA；若待檢樣本DNA的外控CT值≤30，則計算其ΔCT，ΔCT＝突變CT值－外控CT值；若ΔCT>8或者突變CT值無顯示，則判斷為野生型；若ΔCT≤8，則判斷為突變型。本專利技術同現有技術相比，通過聯合采用ARMS技術，建立了血液檢測EGFR基因790密碼子突變的實時PCR定量方法，該檢測方法靈敏度高，可達萬分之一，最低檢測限僅為1-2拷貝，適合于如血清或血漿的檢測；此外，本專利技術所述檢測方法與傳統的測序法相比，本專利技術方法的結果可實時觀察，產物不需要凝膠電泳檢測，完全閉管操作，有效地降低了PCR產物污染的風險；因此，本專利技術方法檢測速度快，能夠適用于高通量的樣本檢測，值得推廣應用。[附圖說明]圖1是顯示本專利技術所述引物及探針的示例性設計；圖2是顯示本專利技術血液陽性品的檢測結果。[具體實施方式]本專利技術提供了一種血液EGFR基因T790M突變檢測方法，該方法中，用于檢測人類EGFR基因T790M突變的引物及探針為：上游引物5’-CCGAAGGGCATGAGCTGCG-3’；下游引物5’-TCCAGGAAGCCTACGTGATC-3’；目標探針FAM-CGGTGGAGGTGAGGCAGATC-BHQ1；PCR反應體系包括酶、dNTP、PCR緩沖液、引物、探針等。檢測時，先從待測樣本中提取DNA，加到PCR反應體系中；然后，進行PCR反應程序和熒光信號檢測，根據熒光信號結果分析，判斷樣本是否存在突變以及突變的比例。本專利技術的檢測EGFR基因790密碼子突變的具體過程為：1)提供引物及探針；2)處理待測樣品并提取模板，該待測樣品為血漿游離DNA；3)配制熒光PCR擴增突變基因序列的反應體系；4)用步驟1)提供的引物擴增待測的基因序列，用步驟1)提供的探針所擴增的產物雜交，并檢測反應體系的熒光基團的熒光信號。下面結合具體實施例對本專利技術作以下進一步說明：1.樣本提取：采用常規方法提取樣本DNA，并進行定量。2.反應液的配制原料50人份加樣量(25μl)10*Buffer25025mMMgCl215025mMAGCU1025mMdTTP1.25上游引物5下游引物5目標探針7.5H2O696.25其中，10*buffer配方為(1ml體系)：3.PCR反應體系：22.5ul反應液，0.5ulTaq酶，2ulDNA模板。4.打開儀器設置窗口，按下面設置PCR擴增與信號收集程序。a)第一階段：94℃，2分鐘b)第二階段：94℃，20秒，40個循環c)第三階段：55℃，10秒，40個循環d)第四階段：65℃，1分鐘，40個循環信號收集：第四階段65℃時收集FAM和VIC信號。5.檢驗結果的解釋：1)若待檢樣本DNA的CT(外控)>30，提示樣本DNA濃度過低或降解嚴重，建議更換樣本或重新提取DNA；2)若待檢樣本DNA的CT(外控)≤30，則計算其ΔCT(CT(突變)-CT(外本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種血液EGFR基因T790M突變的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：1)提供引物及探針；2)從待測樣本中提取DNA模板；3)配制熒光PCR擴增突變基因序列的反應體系；4)將步驟2)提取的DNA模板加到步驟3)所得的PCR反應體系中，用步驟1)提供的引物擴增待測的基因序列，用步驟1)提供的探針所擴增的產物雜交，并檢測反應體系的熒光基團的熒光信號，根據熒光信號結果分析，判斷樣本是否存在突變以及突變的比例。

【技術特征摘要】
1.一種血液EGFR基因T790M突變的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：1)提供引物及探針；2)從待測樣本中提取DNA模板；3)配制熒光PCR擴增突變基因序列的反應體系；4)將步驟2)提取的DNA模板加到步驟3)所得的PCR反應體系中，用步驟1)提供的引物擴增待測的基因序列，用步驟1)提供的探針所擴增的產物雜交，并檢測反應體系的熒光基團的熒光信號，根據熒光信號結果分析，判斷樣本是否存在突變以及突變的比例。2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)中，引物及探針為：上游引物：5’-CCGAAGGGCATGAGCTGCG-3’；下游引物：5’-TCCAGGAAGCCTACGTGATC-3’；探針：FAM-CGGTGGAGGTGAGGCAGATC-BHQ1。3.如權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟2)中，待測樣本為血漿游離DNA。4.如權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟3)中，PCR反應體系包括酶、dNTP、PCR緩沖液、引物、探針。5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中，PCR反應體系的反應液成分及用量為：成分...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張群，祝琳，
申請(專利權)人：上海浦美生物醫藥科技有限公司，
類型：發明
國別省市：上海,31