檢測點突變基因的方法及試劑盒技術

本發明專利技術公開了一種檢測點突變基因的方法，以突變基因為模板，通過連接反應將兩條與點突變基因互補且相鄰的寡核苷酸探針連接成一條完整寡核苷酸鏈，并在寡核苷酸鏈上標記電化學發光分子。然后通過磁性微球捕獲并分離出完整寡核苷酸鏈，最后用電化學發光分析儀檢測完整寡核苷酸鏈上標記的電化學發光分子，通過比較待檢測基因樣品與空白溶液的電化學發光信號強度的差異檢測出點突變基因。本發明專利技術還公開了檢測點突變基因的試劑盒，包含：兩條與點突變基因序列互補的寡核苷酸探針、連接酶、以及表面標記有捕獲分子的磁性微球。本發明專利技術檢測點突變基因的方法，檢測靈敏度高，檢測結果準確、可靠，在腫瘤分子診斷、遺傳分子診斷等領域有很好的應用前景。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物
，具體涉及一種檢測點突變基因的方法及試劑盒。
技術介紹
隨著分子生物學的發展，越來越多的證據顯示惡性腫瘤、遺傳性疾病等困擾人類的重大疾病與基因突變存在密切聯系，而在基因突變類型中又以點突變最為常見，相關的點突變基因檢測技術得到了較快發展。目前，基因測序技術是檢測基因突變的“金標準”，但是由于檢測突變基因時往往存在野生型基因背景的干擾，測序技術受限于靈敏度，難以檢測出豐度低于10%的突變基因。同樣由于野生型基因的干擾作用，聚合酶鏈式反應(PCR)也無法對低豐度的突變基因進行擴增和富集，難以提高突變基因在檢測樣本中的比例。為了提高點突變基因的檢測靈敏度，發展出了基于連接反應的點突變檢測技術，包括連接酶檢測反應(LDR)和連接酶聚合反應(LCR)。兩種方法均采用熒光染料作為信號報告分子，通過檢測報告分子的熒光信號獲得突變基因的信號，提高了突變基因檢測的靈敏度。但是在連接反應中無法分離出突變基因，野生型基因的干擾作用仍無法忽視，限制了檢測靈敏度的提高。而且在熒光信號檢測過程中，每一條突變基因僅標記一個熒光分子，難以獲得足夠高的檢測信號，容易造成假陰性的結果。此外，由于熒光染料分子往往易于淬滅，也影響了熒光信號檢測結果的穩定性。電化學發光技術(ECL)是一種高靈敏檢測技術，具有檢測結果重復性好，易于自動化等優點，已被用于進行免疫方面的檢測，但在基因檢測方面的應用很少，主要原因是用電化學發光分子標記基因后難以從反應中分離出來，未標記的基因以及游離的電化學發光分子對檢測存在較大干擾，這些因素限制了電化學發光技術在突變檢測領域中的應用。專利技術內容本專利技術要解決目前基因 點突變檢測靈敏度不高、檢測過程易受樣本中野生型基因干擾的技術問題，提供一種檢測點突變基因的方法，避免了野生型基因的干擾，提高了點突變基因檢測的靈敏度。此外，還需要提供一種檢測點突變基因的試劑盒。為了解決上述技術問題，本專利技術通過如下技術方案實現:在本專利技術的一個方面，提供了一種檢測點突變基因的方法，包括以下步驟:設計兩條與點突變基因序列互補且相鄰的寡核苷酸探針，即探針I和探針II，其中探針I的5’端標記有識別分子，其3’端的最后一個堿基與點突變的堿基互補配對；探針II的5’端的第一個堿基與點突變堿基相鄰的堿基互補配對，其3’端標記有電化學發光分子;將所述寡核苷酸探針與待檢測基因混合，該兩條寡核苷酸探針以點突變基因為模板，在連接酶的作用下通過連接反應連接成一條完整的寡核苷酸鏈探針，其5’端標記有識別分子，3’端標記有電化學發光分子；將表面標記有捕獲分子的磁性微球與連接反應產物混合，通過捕獲分子與識別分子的特異性結合，將連接后完整的寡核苷酸鏈探針固定在磁性微球的表面；通過外加磁場分離出磁性微球；將分離出的磁性微球加入電化學發光檢測池中，用電化學發光檢測儀檢測連接后完整寡核苷酸鏈探針上的電化學發光分子信號，通過比較待檢測基因樣品與空白溶液的電化學發光信號強度的差異檢測出點突變基因。所述寡核苷酸探針的長度為15 30bp。所述電化學發光分子包括:金屬配合物、魯米諾、吖啶酯、或光澤精。優選的，所述金屬配合物為元素Ru、Os、Cr、Cd、Pd、Pt、Re、Ir、Mo、Tb、Eu、Cu、或Al的金屬配合物。優選的，所述金屬配合物為三聯卩比唳釕(Ru(bpy)3)。所述識別分子包括:生物素、地高辛、與突變基因序列無關的寡核苷酸。所述捕獲分子包括:鏈霉親和素、抗地高辛抗體、或與寡核苷酸識別分子互補配對的寡核苷酸序列。所述磁性微球的平均直徑為0.1-1Oum0優選的，所述磁性微球為超順磁性微球。所述電化學發光檢測池由樣品池、三電極工作系統(參比電極、對電極、工作電極)、電子供體三丙胺(Tripropylamine, TPA)組成。在本專利技術的另一方面，還提供了一種檢測點突變基因的試劑盒，包含:兩條與點突變基因序列互補且相鄰的寡核苷酸探針，即探針I和探針II，其中探針I的5’端標記有識別分 子，其3’端的最后一個堿基與點突變的堿基互補配對；探針II的5’端的第一個堿基與點突變堿基相鄰的堿基互補配對，其3’端標記有電化學發光分子；連接酶；表面標記有捕獲分子的磁性微球，所述捕獲分子與寡核苷酸探針上的識別分子特異性結合。本專利技術檢測點突變基因的方法，對點突變基因具有極高的檢測靈敏度，檢測結果準確、可靠，在腫瘤分子診斷、遺傳分子診斷等領域有很好的應用前景。附圖說明下面結合附圖和具體實施方式對本專利技術作進一步詳細的說明。圖1是本專利技術基于電化學發光反應的點突變基因檢測方法示意圖；圖2是本專利技術實施例1對空白對照、野生型基因、突變型基因的連續5次電化學發光檢測結果圖。具體實施例方式為了提高大量野生型基因背景下低豐度點突變基因的檢測靈敏度，本專利技術研發出了一種檢測點突變基因的方法，該方法將對點突變基因具有高度識別性的特異性連接反應與高靈敏電化學發光(ECL)技術有機結合，以點突變基因為模板，通過連接反應將兩條相鄰的寡核苷酸探針連接在一起，形成一條包括識別分子和電化學發光分子的完整寡核苷酸鏈，從而把對點突變基因的檢測轉化為對連接后完整寡核苷酸鏈的檢測。然后用磁性微球捕獲、分離完整寡核苷酸鏈，最后采用電化學發光方法檢測完整寡核苷酸鏈上的電化學發光分子信號，從而檢測出點突變基因。如圖1所示，本專利技術基于電化學發光反應的檢測點突變基因的方法，包括以下步驟:(I)設計兩條與點突變基因完全互補的寡核苷酸探針(探針I和探針II )，長度均為10 30bp。其中探針I的3’端最后一個堿基與點突變的堿基互補配對，在這條探針的5’端標記有識別分子，用于后續反應中與磁性微球結合。識別分子包括生物素、地高辛、或與突變基因序列無關的寡核苷酸。探針II與突變基因互補配對后，與探針I相鄰，且其5’端處于與發生點突變的堿基相鄰的位置，其3’端標記有電化學發光分子，該電化學發光分子包括:元素Ru, Os, Cr, Cd, Pd, Pt, Re, Ir, Mo, Tb, Eu, Cu, Al的金屬配合物、魯米諾、B丫唆酷、或光澤精。(2)將寡核苷酸探針與待檢測基因混合，在連接酶的作用下進行連接反應，以點突變基因為模板，兩條寡核苷酸探針連接成一條完整的寡核苷酸鏈探針，其3’端標記有電化學發光分子，5’端標記有識別分子；而野生型基因則由于錯配的存在，無法進行連接反應。經過連接反應后，對突變基因的檢測被轉化為對連接后完整寡核苷酸鏈探針的檢測。(3)將表面標記了捕獲分子的磁性微球與連接反應產物混合，磁性微球表面的捕獲分子可以與連接在寡核苷酸探針上的識別分子發生特異性結合，從而將連接后完整的寡核苷酸鏈探針固定在磁性微球的表面。捕獲分子包括:鏈霉親和素、抗地高辛抗體、或與寡核苷酸識別分子互補配對的寡核苷酸序列。(4)在外加磁場的作用下，連接后的完整寡核苷酸鏈探針結合在磁性微球的表面，被磁場吸附，從液相中分尚出來。(5)將分離出來的磁性微球加入到電化學發光檢測池中，用電化學發光檢測儀檢測連接后完整寡核苷酸鏈探針上標記的電化學發光分子信號，通過比較待檢測基因樣品與空白溶液的電化學發光信號強度的差異檢測出樣品中微量的點突變基因。實施例1本專利技術方法對點突變基因的檢測1.設計兩條特異性探針針對P53基因的常見突變位點Y220本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種檢測點突變基因的方法，其特征在于，包括以下步驟：設計兩條與點突變基因序列互補且相鄰的寡核苷酸探針，即探針Ⅰ和探針Ⅱ，其中探針I的5’端標記有識別分子，其3’端的最后一個堿基與點突變的堿基互補配對；探針Ⅱ的5’端的第一個堿基與點突變堿基相鄰的堿基互補配對，其3’端標記有電化學發光分子；將所述寡核苷酸探針與待檢測基因混合，該兩條寡核苷酸探針以點突變基因為模板，在連接酶的作用下通過連接反應連接成一條完整的寡核苷酸鏈探針，其5’端標記有識別分子，3’端標記有電化學發光分子；將表面標記有捕獲分子的磁性微球與連接反應產物混合，通過捕獲分子與識別分子的特異性結合，將連接后完整的寡核苷酸鏈探針固定在磁性微球的表面；通過外加磁場分離出磁性微球；將分離出的磁性微球加入電化學發光檢測池中，用電化學發光檢測儀檢測連接后完整寡核苷酸鏈探針上的電化學發光分子信號，通過比較待檢測基因樣品與空白溶液的電化學發光信號強度的差異檢測出點突變基因。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：程昌明，汪杰，楊超，
申請(專利權)人：上海生物芯片有限公司，
類型：發明
國別省市：