HIV-1病毒蛋白酶抑制劑耐藥突變檢測試劑盒及方法技術

本發明專利技術涉及一種檢測HIV-1蛋白酶抑制劑耐藥突變的方法及其試劑盒。具體而言，本發明專利技術還公開了檢測人類免疫缺陷病毒蛋白酶基因耐藥突變的探針，包括檢測蛋白酶基因D30N突變的探針、檢測蛋白酶基因V32I突變的探針、檢測蛋白酶基因M46I和M46L突變的探針、檢測蛋白酶基因I47V和I47A突變的探針、檢測蛋白酶基因G48V突變的探針、檢測蛋白酶基因I50V突變的探針、檢測蛋白酶基因I54V突變的探針、檢測蛋白酶基因V82A、V82F、V82T和V82S突變的探針、檢測蛋白酶基因I84V突變的探針、檢測蛋白酶基因N88D突變的探針、檢測蛋白酶基因L90M突變的探針。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及檢測Hiv-1蛋白酶抑制劑耐藥突變的方法及其試劑盒。
技術介紹
一、蛋白酶抑制劑類藥物及其作用機制獲得性免疫缺陷綜合癥(AcquiredImmune Deficiency Syndrome, AIDS),又稱艾滋病，是世界十大致命疾病之一，其病原體為HIV-1 (Human Immunodeficiency Virus,HIV),HIV屬于逆轉錄病毒，分為HIV-1型和HIV-2型。世界上大部分地區的艾滋病患者是被HIV-1病毒所感染。蛋白酶(Prote ase)對于HIV-1病毒中gag,gag-pol多聚蛋白和翻譯后加工、形成病毒核心的結構蛋白以及其他基本的酶類，都是十分必要的。HIV-1病毒進入血液后，病毒表面的包膜蛋白gpl20和OT4 + T淋巴細胞表面的⑶4受體結合，在gp41透膜蛋白的作用下，侵入細胞并脫殼。蛋白酶抑制劑(Protease Inhibitors，PIs)主要以氫鍵方式與HIV-1病毒蛋白酶的Asp25、GLy27、Asp29殘基相互作用，與蛋白酶活性中的氨基酸殘基形成立體相互作用，使病毒蛋白的長鏈不能裂開，從而抑制蛋白酶的活性，致使HIV在被感染的細胞中產生不成熟的、不具有感染性的病毒顆粒，從而達到使病毒不能正常裝配，抑制HIV目的。自1994年肽底物類似物蛋白酶抑制劑問世以來，截至目前，經美國FDA批準上市的此類抑制劑已有10種，其中洛匹那韋(1pinavir/r, LPV)、阿扎那韋(atazanavir/r,ATv)、福沙普利那韋(fosamprenavir/r)和沙奎那韋(saquinavir/r, SQV)用于一線治療，替拉那韋(fipranavir/r)和大諾那韋(darunavir/r)用于挽救治療。這類藥物能迅速降低血漿中HIV-1病毒載量，療效突出，蛋白酶抑制劑已成為AIDS聯合用藥方案的重要組成部分，同時在補救治療(Salvage therapy)中亦發揮重要作用。二、HIV-1病毒蛋白酶抑制劑耐藥類型及機制HIV蛋白酶是一個具有底物結合腔，呈中心對稱的同型二聚體，在特定位點剪切大分子多肽前體，釋放裝配感染性病毒顆粒所必須的結構蛋白和酶。當缺少這些功能蛋白酶時，則只能生成沒有感染能力的不成熟病毒顆粒。蛋白酶抑制劑對HIV蛋白酶活性位點均具強親和力，可抑制酶的催化活性。蛋白酶抑制劑發生耐藥的機制是HIV蛋白酶底物結合域或其遠端位點的氨基酸置換，直接或間接修改了 PIs與酶接觸位點的數量和性質，進而降低PIs與酶的親和力。迄今已發現與Pls耐藥相關的HIV-1突變有60多個，主要的耐藥位點有23、30、32、47、48、50、82和84 ;位于邊緣的46,54位點；位于酶內部的76,88和90。24、33、53和73位突變經常出現，這些位點對不同的Pls有不同的影響。L231、D30N、M46WL、G48V/M、184V、N88D/S和L90M突變會降低對奈非那韋(nelfinavlr, NFV)的敏感性;I50L、N88S和184V降低對ATV的敏感性；G48V/M、184V和L90M降低對SQV的敏感性；V321、147V/A、154L/M和184V降低對fosamprenavir/r的敏感性；V47A降低對LPV的敏感性；V82L/T與tipranavir/r耐藥有關。有些突變可以增加一種或多種PIs的敏感性:I50L可以增加所有PIs的敏感性；I50V和154L可增加tipranavir敏感性；N88S可增加fosamprensvir敏感性；L76V可增加Alrv、SQV和fipranavir的敏感性。PI類耐藥突變發生比較慢，多個位點突變才產生完全耐藥，交叉耐藥比較少見，耐藥突變具有藥物特異性。例如，D30N位點突變與NFV有關，150V突變與APV有關，G48V和L90M突變與SQV有關，I50L突變與ATV相關。然而，蛋白酶其他位點，如編碼區82、84、90位點突變將產生交叉耐藥。三、HIV-1的耐藥檢測方法目前HIV-1病毒耐藥性檢測有兩種方法，即表型檢測及基因型檢測。表型檢測通過用藥期間的病毒培養進行，而基因型檢測則通過分子生物學方法檢測與耐藥性相關的病毒基因突變。基因型檢測的方法有直接測序法、異源雙鏈軌跡試驗(HTA)、PCR連續酶測定試驗、線性探針試驗、限制性內切酶酶切試驗、引物特異的PCR測定、RNA酶A(RNase A)錯配剪切試驗等，其中部分技術已有商用系統。在進行基因測序后，將測序結果與標準病毒株比較后可坦福大學耐藥數據庫(http://hivdb.stanford.edu/)及Los Alamos HIV耐藥數據庫。通過輸入所測得的序列，數據庫可自動提供病毒基因變異及耐藥結果。目前已有基于測序技術的商品化的試劑盒:TRUEGENE HIV-1Genotyping Kit (Visible Genetics, Inc.Toronto, Canada)和 ViroSeq Kit (Applied Biosystems, Inc.Foster City, CA, USA)。兩者都已獲得美國FDA批準成為應用于臨床常規檢測的試劑盒。此外，基于線性探針技術(Line probe assay)的商品化的試劑盒 LiPA(Innogenetics,Ghent,Belgium)也已用于實驗室研究。基因型檢測的優點是可提供交叉耐藥資料，可在樣品收集后I 2周得到結果，技術步驟較少，一般情況下費用較便宜。但也存在明顯缺點，即不直接提供藥物的耐受程度，無法定量，部分變異位點與臨床耐受的相關性無法完全確認，分析基因型耐藥檢測時，需要掌握大量相關知識，如突變與抗病毒藥物及其它藥物的交叉耐藥等，才能對結果進行正確的分析。表型檢測通過病毒培養，再通過與無耐藥性個體減少HIV復制50%或90%(50%or90%inhibitory concentration, IC50or IC90)所需的藥物水平比較來分級耐藥程度。表型分析的標準方法是首先從病人體內分離病毒，與待檢藥物共同培養，然后測定不同藥物濃度下外周血單核細胞(PBMC)所產生的p24抗原量，據此得到IC5(I。該法步驟復雜，對操作技術要求高，整個過程至少需6周時間，病毒分離培養過程還有可能發生變異。重組表型方法將病人體內HIV-1的蛋白酶和逆轉錄酶基因序列進行RT-PCR擴增，擴增產物繼而插入pol基因缺失型HIV-1載體以形成重組病毒，因此重組病毒保持了病人體內病毒對藥物的敏感性，然后在不同藥物，同一藥物不同濃度下對重組病毒進行培養，即可測定出對藥物的敏感性。表型耐藥檢測的結果與基因型檢測結果通常相同，但有時亦有差異。當耐藥HIV株水平較低時，表型檢測可發現基因型檢測所沒有提示的耐藥性變異。表型耐藥是耐藥檢測的金標準，直接提供藥物的耐受情況，可定量，但缺點也很明顯，即技術要求高、費時、費用高昂，因此目前國際上廣泛應用于臨床的是基因型耐藥檢測。 基因型和表型檢測的進一步應用限制，包括缺乏對現有檢測方法的質量保證；檢測費用較高；對微小病毒標本不敏感；如果存在耐藥病毒，而病毒量又低于20%，現有檢測方法很可能檢測不到。
技術實現思路
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【技術保護點】
檢測人類免疫缺陷病毒蛋白酶基因耐藥突變的特異性探針，其特征是：包括以下11類特異性探針中的至少一類：檢測蛋白酶基因D30N突變的特異性探針，為SEQ?ID?NO:1~6中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測蛋白酶基因V32I突變的特異性探針，為SEQ?ID?NO:7~14中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測蛋白酶基因M46I和M46L突變的特異性探針，為SEQ?ID?NO:15~31中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測蛋白酶基因I47V和I47A突變的特異性探針，為SEQ?ID?NO:32~40中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測蛋白酶基因G48V突變的特異性探針，為SEQ?ID?NO:41~46中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測蛋白酶基因I50V突變的特異性探針，為SEQ?ID?NO:47~52中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測蛋白酶基因I54V突變的特異性探針，為SEQ?ID?NO:53~61中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測蛋白酶基因V82A、V82F、V82T和V82S突變的特異性探針，為SEQ?ID?NO:62~81中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測蛋白酶基因I84V突變的特異性探針，為SEQ?ID?NO:82~87中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測蛋白酶基因N88D突變的特異性探針，為SEQ?ID?NO:88~93中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測蛋白酶基因L90M突變的特異性探針，為SEQ?ID?NO:94~99中的任意一種或任意一種的互補序列。...

【技術特征摘要】
1.檢測人類免疫缺陷病毒蛋白酶基因耐藥突變的特異性探針，其特征是: 包括以下11類特異性探針中的至少一類: 檢測蛋白酶基因D30N突變的特異性探針，為SEQ ID NO:1飛中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測蛋白酶基因V32I突變的特異性探針，為SEQ ID NO:7 14中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測蛋白酶基因M46I和M46L突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 15 31中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測蛋白酶基因I47V和I47A突變的特異性探針，為SEQ ID NO:32^40中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測蛋白酶基因G48V突變的特異性探針，為SEQ ID NO:41 46中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測蛋白酶基因I50V突變的特異性探針，為SEQ ID NO:47 52中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測蛋白酶基因I54V突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 53 61中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測蛋白酶基因V82A、V82F、V82T和V82S突變的特異性探針，為SEQ ID NO:62^81中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測蛋白酶基因I84V突變的特異性探針，為SEQ ID NO:82 87中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測蛋白酶基因N88D突變的特異性探針，為SEQ ID NO:88 93中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測蛋白酶基因L90M突變的特異性探針，為SEQ ID NO:94 99中的任意一種或任意一種的互補序列。2.根據權利要求1所述的檢測人類免疫缺陷病毒蛋白酶基因耐藥突變的特異性探針，其特征是: 所述檢測蛋白酶基因D30N突變的特異性探針中，SEQ ID NO: f 3中的任意一種針對第30位氨基酸殘基為D的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 4 6中的任意一種針對第30位氨基酸殘基為N的HIV-1蛋白酶基因； 所述檢測蛋白酶基因V32I突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 7、中的任意一種針對第32位氨基酸殘基為V的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 1(Γ 4中的任意一種針對第32位氨基酸殘基為I的HIV-1蛋白酶基因； 所述檢測蛋白酶基因Μ46Ι和M46L突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 15 17中的任意一種針對第46位氨基酸殘基為M的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 18 20中的任意一種針對第46位氨基酸殘基為I的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID ΝΟ:2Γ31中的任意一種是針對第46位氨基酸殘基為L的HIV-1蛋白酶基因； 所述檢測蛋白酶基因I47V和Ι47Α突變的特異性探針中，SEQ ID NO:32^34中的任意一種是針對第47位氨基酸殘基為I的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 35 37中的任意一種是針對第47位氨基酸殘基為A的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 38 40中的任意一種是針對第47位氨基酸殘基為V的HIV-1蛋白酶基因； 所述檢測蛋白酶基因G48V突變的特異性探針中，SEQ ID NO:41 43中的任意一種是針對第48位氨基酸殘基為G的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 44 46中的任意一種是針對第48位氨基酸殘基為V的HIV-1蛋白酶基因； 所述檢測蛋白酶基因I50V突變的特異性探針中，SEQ ID NO:47 49中的任意一種是針對第50位氨基酸殘基為I的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO:50^52中的任意一種是針對第50位氨基酸殘基為V的HIV-1蛋白酶基因； 所述檢測蛋白酶基因I54V突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 53 55中的任意一種是針對第54位氨基酸殘基為I的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO:56^61中的任意一種是針對第54位氨基酸殘基為V的HIV-1蛋白酶基因； 所述檢測蛋白酶基因V82A、V82F、V82T和V82S突變的特異性探針中，SEQ ID NO:62^66中的任意一種是針對第82位氨基酸殘基為V的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 67 69中的任...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張瓊，李蘭娟，項春生，吳南屏，
申請(專利權)人：浙江大學，
類型：發明
國別省市：