快速高效檢測(cè)蛹蟲草不同菌種交配型的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供一種快速高效檢測(cè)蛹蟲草不同菌種交配型的方法。基于雙重PCR技術(shù)，設(shè)計(jì)檢測(cè)蛹蟲草不同菌種交配型MAT1?1和MAT1?2的PCR引物組合Cm1F/Cm1R(Seq?ID?No:1?2)和Cm2F/Cm2R(Seq?ID?No:3?4)，實(shí)現(xiàn)“一步法”快速、準(zhǔn)確地鑒定不同菌種交配型目的，縮減了鑒定時(shí)間，節(jié)約了試劑用量，降低了鑒定成本，為開展高效經(jīng)濟(jì)型人工栽培蛹蟲草及天然蛹蟲草資源保護(hù)與利用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及多重PCR檢測(cè)技術(shù)，具體地說，涉及一種快速高效檢測(cè)蛹蟲草不同菌種交配型的方法。
技術(shù)介紹
蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)俗稱北蟲草、北冬蟲夏草，是一種珍貴的藥用真菌及中藥材，世界性分布天然資源數(shù)量很少。蛹蟲草作為一種“藥食同源”滋補(bǔ)佳品，在中西醫(yī)治療與保健方面得到廣泛認(rèn)可和應(yīng)用。蛹蟲草也作為一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的藥(食)用菌。但是野生蛹蟲草的產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境條件特殊，極大地限制了蛹蟲草的生長(zhǎng)區(qū)域范圍及產(chǎn)量，加之近年來野生資源過度開發(fā)導(dǎo)致其野生資源日趨枯竭。隨著對(duì)蛹蟲草生物學(xué)特性的認(rèn)識(shí)深入和技術(shù)探索提高，蛹蟲草實(shí)現(xiàn)了人工培養(yǎng)，其藥用及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值不遜于野生蛹蟲草，其藥用價(jià)值可與冬蟲夏草相媲美，部分營(yíng)養(yǎng)價(jià)值甚至更高。作為替代名貴中藥冬蟲夏草作為藥(食)用菌已被廣泛接受。目前，蛹蟲草生產(chǎn)中通常以傳統(tǒng)方法分離蛹蟲草菌株，作為生產(chǎn)使用的菌種。這類菌種由于生物學(xué)及遺傳背景等特征不清楚，導(dǎo)致栽培過程中出現(xiàn)菌種退化及變異嚴(yán)重，從而引起蛹蟲草栽培形成的子實(shí)體畸形、品質(zhì)下降甚至減產(chǎn)等嚴(yán)重問題，極大地制約了蛹蟲草的生產(chǎn)與開發(fā)規(guī)模。蛹蟲草的主要藥用組織—子實(shí)體為有性生殖的產(chǎn)物。真菌交配型是調(diào)控有性生殖的重要遺傳基礎(chǔ)之一，蛹蟲草作為一種典型的異宗配合子囊門真菌，其交配型具有二極性特點(diǎn)，即有性生殖的發(fā)生與子實(shí)體的形成需要兩個(gè)不同交配型(MAT1-1和MAT1-2)。利用分子生物學(xué)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)(PCR)方法，可以有效針對(duì)蛹蟲草的單分生孢子和子囊孢子來源的菌種，進(jìn)而對(duì)蛹蟲草菌種的遺傳背景進(jìn)行有效鑒定，為后續(xù)不同交配型菌種的混合雜交以實(shí)現(xiàn)子實(shí)體的形成，以及相關(guān)的蛹蟲草生物學(xué)特性研究提供良好的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。目前為止，為明確不同來源菌種的交配型，避免部分遺傳背景不單一或混雜的菌種同時(shí)存在兩個(gè)交配型的現(xiàn)象，需要分別進(jìn)行兩次PCR反應(yīng)用以明確菌種的交配型類型，這種對(duì)不同菌種的交配型進(jìn)行鑒定的方法存在鑒定方案效率低，鑒定周期較長(zhǎng)，試劑消耗量大等缺陷。因此，有必要研發(fā)一套快速高效的蛹蟲草交配型鑒別方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種基于雙重PCR技術(shù)的，快速高效檢測(cè)蛹蟲草不同菌種交配型的方法。為了實(shí)現(xiàn)本專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)提供用于雙重PCR檢測(cè)蛹蟲草不同菌種交配型的引物組合，所述引物組合包括，用于鑒定交配型MAT1-1的特異性引物對(duì)(SeqIDNo:1-2)：Cm1F：5′-TCCAAGCCTCAATCGAC-3′Cm1R：5′-AACAAGCATCTTGGTAC-3′；以及用于鑒定交配型MAT1-2的特異性引物對(duì)(SeqIDNo:3-4)：Cm2F：5′-ACCGACATACGCTTGTC-3′Cm2R：5′-ATGCCGTTCGAGGAGAG-3′。本專利技術(shù)還提供含有所述引物組合的用于PCR檢測(cè)蛹蟲草不同菌種交配型的試劑盒。所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)陽性模板等中的至少一種。本專利技術(shù)還提供所述引物組合、含有所述引物組合的試劑盒在PCR檢測(cè)蛹蟲草不同菌種交配型中的應(yīng)用。本專利技術(shù)進(jìn)一步提供一種快速高效檢測(cè)蛹蟲草不同菌種交配型的方法，包括以下步驟：1)提取樣品中的DNA；2)以步驟1)中提取的DNA為模板，利用引物組合Cm1F/Cm1R和Cm2F/Cm2R進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增反應(yīng)；3)分析PCR產(chǎn)物。其中，PCR反應(yīng)體系以20μl計(jì)為：PCR反應(yīng)條件為：95℃3分鐘；95℃30秒，45-53℃30-45秒，72℃30秒，25-40個(gè)循環(huán)；72℃5-15分鐘；4℃保存。可采用0.8-1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。如果擴(kuò)增出396bp和205bp兩條特征條帶，則表明樣品中含有MAT1-1和MAT1-2兩種交配型；如果僅擴(kuò)增出396bp一條特征條帶，則表明樣品中含有交配型MAT1-1；如果僅擴(kuò)增出205bp一條特征條帶，則表明樣品中含有交配型MAT1-2。可按照如下方法提取樣品DNA：挑取少量蛹蟲草菌絲，與650μL提取緩沖液(100mMTris-HCl,pH8.0；50mMEDTA，pH8.0；1％SDS；10μg/mLRNaseA)混合，震蕩10-60秒；加入100μL醋酸鉀(KAc，3.0M，pH5.5，4℃保存)溶液，震蕩混勻,在8000-12000rpm離心2-5min；取上清液300-750μL到另一無菌離心管中；加入500-800μL氯仿，與上清液混合，在8000-12000rpm離心2-5min；取上清液300-750μL到新的無菌離心管中，加入500-800μL冰凍預(yù)冷-20℃的異丙醇，混合均勻，-20℃靜置10-60min，然后在8000-12000rpm離心2-5min，去除上清液后；離心沉淀用500-1000μL70％乙醇，清洗2-5次；無菌風(fēng)或真空離心濃縮儀干燥后，溶解于10-100μL無菌水或TE緩沖液中，通過超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的純度和濃度。本專利技術(shù)結(jié)合現(xiàn)代真菌學(xué)研究技術(shù)手段，建立了一套高效和經(jīng)濟(jì)的蛹蟲草菌種交配型鑒定技術(shù)體系，首次提出“一步法”快速檢測(cè)鑒定方法，即在一個(gè)PCR反應(yīng)中加入兩對(duì)不同交配型基因引物，實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確地鑒定不同菌種交配型目的，同時(shí)縮減了鑒定時(shí)間，節(jié)約了試劑用量，降低了鑒定成本，為開展高效經(jīng)濟(jì)型人工栽培蛹蟲草及天然蛹蟲草資源保護(hù)與利用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。附圖說明圖1為本專利技術(shù)實(shí)施例2中蛹蟲草基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果；其中，M為DNAMarker，1和2分別為2000ng和4000ng基因組DNA。圖2為本專利技術(shù)實(shí)施例2中對(duì)蛹蟲草基因組DNA模板量的優(yōu)化結(jié)果；其中，M為DNAMarker，1-5分別為模板DNA用量500ng，200ng，100ng，10ng，1ng。圖3為本專利技術(shù)實(shí)施例2中對(duì)PCR反應(yīng)退火溫度的優(yōu)化結(jié)果；其中，M為DNAMarker，1-6分別為退火溫度45℃，47℃，49℃，51℃，53℃，55℃。圖4為本專利技術(shù)實(shí)施例2中“一步法”與常規(guī)“二步法”的PCR檢測(cè)結(jié)果比較；其中，M為DNAMarker，常規(guī)“二步法”PCR(分別使用交配型引物之一)：其中1-3和4-6為交配型MAT1-1引物擴(kuò)增單子囊孢子代表菌株S1-3(MAT1-1)和S4-6(MAT1-2)的模板DNA，7-9和10-12為交配型MAT1-2引物擴(kuò)增菌株S1-3和S4-6的模板DNA；13-22，快速“一步法”PCR(同時(shí)使用兩個(gè)交配型引物)：其中13-15和16-18為擴(kuò)增菌株S1-3和S4-6的模板DNA，19-21擴(kuò)增菌株S1和S4，S2和S5，S3和S6的混合模板DNA，22擴(kuò)增子實(shí)體模板DNA。圖5為本專利技術(shù)實(shí)施例3中對(duì)不同來源的蛹蟲草菌種交配型進(jìn)行“一步法”PCR檢測(cè)；其中，M為DNAMarker，1-18為不同來源的單子囊孢子菌株。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說明本專利技術(shù)，但不用來限制本專利技術(shù)的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(SambrookJ&RussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。以下實(shí)施例中所用蛹蟲草菌株S1-S6為子實(shí)體分離獲得的單子囊孢子菌株，保本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
用于雙重PCR檢測(cè)蛹蟲草不同菌種交配型的引物組合，其特征在于，所述引物組合包括，用于鑒定交配型MAT1?1的特異性引物對(duì)：Cm1F：5′?TCCAAGCCTCAATCGAC?3′Cm1R：5′?AACAAGCATCTTGGTAC?3′；以及用于鑒定交配型MAT1?2的特異性引物對(duì)：Cm2F：5′?ACCGACATACGCTTGTC?3′Cm2R：5′?ATGCCGTTCGAGGAGAG?3′。

【技術(shù)特征摘要】
1.用于雙重PCR檢測(cè)蛹蟲草不同菌種交配型的引物組合，其特征在于，所述引物組合包括，用于鑒定交配型MAT1-1的特異性引物對(duì)：Cm1F：5′-TCCAAGCCTCAATCGAC-3′Cm1R：5′-AACAAGCATCTTGGTAC-3′；以及用于鑒定交配型MAT1-2的特異性引物對(duì)：Cm2F：5′-ACCGACATACGCTTGTC-3′Cm2R：5′-ATGCCGTTCGAGGAGAG-3′。2.含有權(quán)利要求1所述引物組合的用于PCR檢測(cè)蛹蟲草不同菌種交配型的試劑盒。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)陽性模板中的至少一種。4.權(quán)利要求1所述引物組合、權(quán)利要求2或3所述試劑盒在PCR檢測(cè)蛹蟲草不同菌種交配型中的應(yīng)用。5.一種快速高效檢測(cè)蛹蟲草不同菌種交配型的方法，其特征在于，包括以下步驟：1)提取樣品中的DNA；2)以步驟1)中提取的DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物組合進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增反應(yīng)；3)分析PCR產(chǎn)物。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)體系以20μl計(jì)為：7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)條件為：95℃3分鐘；95℃30秒，45-53℃30-45秒，72℃30秒，25-40個(gè)循環(huán)；72℃5-15分鐘；4℃保存。8.根據(jù)權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)所述的方法，其特征...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：梁月，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：遼寧;21