新型肽標簽以及其用途制造技術

本發明專利技術涉及一種源自耐輻射球菌(Deinococcus?radiodurans)的感光蛋白質的細菌光敏色素(Bacteriophytochrome，BphP)的肽標簽，能夠特異地識別上述肽標簽的抗體，能夠產生上述抗體的雜交瘤細胞株和它們的用途。根據本發明專利技術的新型肽標簽具有短的長度的同時，具有能夠消除現有的c-myc標簽及FLAG標簽等的非特異性反應的優點。因此，利用根據本發明專利技術的新型肽標簽及其對應的抗體時，能夠非常有效地檢測或者純化重組細胞內表達的融合蛋白質。并且，包括根據本發明專利技術的新型肽標簽及與其對應的抗體的表位標記系統可以適用于特定蛋白質的細胞內定位，功能鑒定，檢測，純化，以及研究蛋白質間的相互作用等的各種領域中。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及一種用于目的蛋白質的檢測或純化的表位(epitope)標記系統，更詳細的說，涉及一種源自作為耐輻射球菌(Deinococcusradiodurans)的感光蛋白質(photoreceptorprotein)的細菌光敏色素(Bacteriophytochrome，BphP)的新型肽標簽，以及能夠特異地識別上述肽標簽的抗體及能夠產生上述抗體的雜交瘤細胞株。并且，本發明還涉及編碼上述肽標簽的多核苷酸；涉及包括上述多核苷酸的載體或轉化體；以及包括上述肽標簽的融合蛋白質及用于制備、檢測或純化上述融合蛋白質的方法和試劑盒。
技術介紹
有用的蛋白質或多肽可通過合成產生或者可以從天然供給源中分離。但是，這種方法存在在費用、時間方面并不經濟，且生產量有限的缺點。因此，優選通過對重組制備的轉化體進行培養而生產目的蛋白質和目的多肽，其中上述重組是為使目的蛋白質或目的多肽過表達而進行的。但是，在細胞環境中產生的多肽(特別是短的多肽)由于存在于細胞的蛋白酶的作用而易降解(degradation)，而且，并不是所有目的蛋白質都有抗體，因此不易純化沒有對應抗體的目的蛋白質。為了克服這些問題使用了蛋白質標記或表位標記。蛋白質標記(proteintagging)或者表位標記(epitopetagging)是制備將表位標記的編碼序列連接于目的蛋白質的編碼序列的重組核酸分子后，使其在合適的宿主細胞中表達，再利用對應于表位標記的抗體對目的蛋白質進行檢測、定量、純化或在目的蛋白質的細胞內追蹤位置，功能鑒定等的一種重組DNA方法。商業上有很多表位標簽和作為其相應配體的抗體，當選擇合適抗體的表位標簽和其對應的抗體時，能夠使用蛋白質印跡分析(Westernblotanalysis)，免疫沉淀(immunoprecipitation)，免疫熒光(immunofluorescence)，免疫細胞化學(immunocytochemistry)，免疫親和純化(immunoaffinitypurification)等方法對目的蛋白質進行檢測或純化，因此可以消除對目的蛋白質產生抗體的必要性。目前使用于蛋白質標記(proteintagging)或者表位標記(epitopetagging)的表位標簽有從六個氨基酸殘基程度的短肽標簽(例如，6×組氨酸(Histidine，His)標簽)至40kDa程度大的蛋白質(例如，MBP)的很多獨特的標記[參見Stevens,R.C.,(2000)StructureFoldDes8:R177-85]，而一般會使用由3至30個氨基酸構成的肽標簽。His-標記的蛋白質在Ni-NTA(鎳-次氮基三乙酸)的樹脂上被特異性地捕獲，且其可以通過EDTA或咪唑被洗脫下來。除此之外，麥芽糖結合蛋白質(MBP)(396個氨基酸，40kDa)、金黃色葡萄球菌蛋白質A、鈣調蛋白質結合肽(CBP)(26個氨基酸，2.96kDa)、綠色熒光蛋白質(GreenFluorescentProtein，GFP)(238個氨基酸，27kDa)及谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)(211個氨基酸，26kDa)也可用于原核生物及真核生物蛋白質的檢測或純化。并且，通常最常用的表位標簽有c-myc標簽，HA標簽，FLAG標簽等。c-myc標簽是源于人的c-myc蛋白質的長度為10個氨基酸的表位標簽[Evansetal.,(1985)Mol.Cell.Biol.,12:3610-3616]，HA標簽是源自流感病毒血凝素(influenzahemagglutinin)HA-1蛋白質的長度為9個氨基酸的表位標簽[Fieldetal.,(1988)Mol.Cell.Biol.,8:2159-2165]，FLAG標簽是源自噬菌體T7的長度為8個氨基酸的表位標簽[Hoppetal.,(1988)Bio/Technology,6:1204-1210]。另外，對于進行表位標記時所使用的表位標簽，應優選使用當其與目的蛋白質融合時，對目的蛋白質的三維結構和生物活性影響最小的表位標簽。一般長度長的表位標簽(例如GST標簽或者MBP標簽)會存在改變目的蛋白質的功能等的問題。相反，長度相對較短的表位標簽，例如，FLAG標簽、c-myc標簽等，幾乎不影響與其融合的目的蛋白質的特性，且能夠與其對應的抗體高度特異地結合，并且，有些時候不需要從融合蛋白質中去除，因此是現在主要使用的表位標簽。但是，對于c-myc標簽和FLAG標簽的氨基酸序列，迄今為止已知的生物體的細胞內的蛋白質中大多數的蛋白質含有相同的序列，從而可能會誘導識別標簽的抗體的非特異性反應，而這種非特異性抗體反應會妨礙對特定目的蛋白質的分離及確認，因此存在會降低試驗的可靠性的問題[KsenijaGasicetal.,(2005)Plantmolecularbiologyreporter23:9-16]。為了克服這種非特異性反應的問題，曾開發過在蛋白質的N-末端連續融合兩個不同的標簽后使用的親和純化系統[Rigaut,G.,etal.(1999)NatBiotechnol17:1030-2]。因此，需要開發一種新型肽標簽以及可與其配對使用的抗體。上述新型肽標簽以及可與其配對使用的抗體可以克服現有技術中利用表位標簽及其對應的抗體對在重組宿主細胞內表達的融合蛋白質進行檢測及純化時存在的問題，即可以克服非特異性反應，同時具有較短的氨基酸序列。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題本專利技術的所要解決的一個技術問題在于，提供一種對檢測或者純化目的蛋白質有效的新型肽標簽，以及其用途。本專利技術所要解決的另一個技術問題在于，提供一種能夠特異地識別新型肽標簽或能夠與新型肽標簽選擇性結合的新型抗體，能夠產生上述抗體的雜交瘤細胞株及其用途。技術方案本專利技術的專利技術人在為了開發對目的蛋白質的檢測或者純化有用的肽標簽及相對應抗體而進行研究的過程中，使用耐輻射球菌(Deinococcusradiodurans)的感光蛋白質細菌光敏色素(Bacteriophytochrome，BphP)或者其片段作為免疫原，獲得產生單克隆抗體的雜交瘤，其中上述耐輻射球菌為異養細菌。同時，利用產生的抗體，以耐輻射球菌(Deinococcusradiodurans)的細菌光敏色素(Bacteriophytochrome，BphP)為對象進行了表位鑒定(epitopemapping)，發現了由9個氨基酸構成的表位，從而完成了本專利技術。為解決上述一個目的，本專利技術提供一種肽標簽，其包含由SEQIDNO：1的氨基酸序列構成的肽或者由SEQIDNO：2的氨基酸序列構成的肽，作為抗體的識本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種肽標簽，其中，該肽標簽包含由SEQ?ID?NO：1的氨基酸序列構成的肽或者由SEQ?ID?NO：2的氨基酸序列構成的肽，作為抗體的識別部位或者抗體的結合部位。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2012.07.20 KR 10-2012-0079615;2012.11.06 KR 10-2011.一種肽標簽，其中，該肽標簽包含由SEQIDNO：1的氨基酸序列構成的肽或者由SEQ
IDNO：2的氨基酸序列構成的肽，作為抗體的識別部位或者抗體的結合部位。
2.一種多核苷酸，其為編碼肽標簽的多核苷酸，其特征在于，
所述肽標簽包含由SEQIDNO：1的氨基酸序列構成的肽或者由SEQIDNO：2的氨基酸
序列構成的肽，作為抗體的識別部位或者抗體的結合部位。
3.根據權利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，
編碼所述肽標簽的多核苷酸包括SEQIDNO：7堿基序列或者SEQIDNO：8堿基序列。
4.根據權利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，
編碼所述肽標簽的多核苷酸通過具有SEQIDNO：16的堿基序列的正向引物和具有SEQ
IDNO：17的堿基序列的反向引物構成的引物對，或者由具有SEQIDNO：32的堿基序列的正
向引物和具有SEQIDNO：33的堿基序列的反向引物構成的引物對而合成。
5.一種重組載體，其中，該重組載體包括編碼權利要求2所述的肽標簽的多核苷酸。
6.根據權利要求5所述的重組載體，其特征在于，
編碼所述肽標簽的多核苷酸包括SEQIDNO：7的堿基序列或者SEQIDNO：8的堿基序
列。
7.根據權利要求6所述的重組載體，其特征在于，
編碼所述肽標簽的多核苷酸通過具有SEQIDNO：16的堿基序列的正向引物和具有SEQ
IDNO：17的堿基序列的反向引物構成的引物對，或者由具有SEQIDNO：32的堿基序列的正
向引物和具有SEQIDNO：33的堿基序列的反向引物構成的引物對而合成。
8.根據權利要求5所述的多重組載體，其特征在于，
所述重組載體為克隆載體或者表達載體。
9.根據權利要求8所述的重組載體，其特征在于，
所述表達載體進一步包括編碼目的蛋白質的目的多核苷酸，
其中，所述目的多核苷酸與編碼肽標簽的多核苷酸連接。
10.一種融合蛋白質，其特征在于，
該融合蛋白質包括目的蛋白質及與其連接的肽標簽，
其中，所述肽標簽包含由SEQIDNO：1的氨基酸序列構成的肽或者由SEQIDNO：2的氨
基酸序列構成的肽，作為抗體的識別部位或者抗體的結合部位。
11.一種多核苷酸，其中，該...

【專利技術屬性】
技術研發人員：夫盛熙，韓胎龍，金兌林，徐胄源，梁勝煥，
申請(專利權)人：慶熙大學校產學協力團，明知大學校產學協力團，
類型：發明
國別省市：韓國;KR