SIRT6的調節物及其篩選分析制造技術

一種鑒定Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性調節物的方法，其中在Sirt6、PfSir2a或Sirt7使底物去酰基的條件下，在存在候選化合物的情況下將含有酰基?賴氨酸部分和指示物部分的脂肪?酰基化底物與Sirt6、PfSir2a或Sirt7接觸，其中所述酰基是疏水性脂肪酰基基團，其含有至少三個通過碳?碳鍵連接的碳原子的烴基；將所述去酰基化的底物與裂解試劑接觸，所述裂解試劑裂解所述賴氨酸與指示物部分之間的連接以產生可檢測的信號；且由此關聯定量的Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶的活性。本申請還描述了Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性的調節化合物，及其藥物組合物，通過給予所述調節化合物的治療方法，以及實施所述方法的試劑盒。

【技術實現步驟摘要】
本申請是申請號為201180068116.3、申請日為2011年12月21日、專利技術名稱為“SIRT6的調節物及其篩選分析”的中國專利技術專利申請的分案申請，原申請為國際申請號為PCT/US2011/066480的國家階段申請，該國際申請要求申請日為2010年12月22日，申請號為61/426,231的美國臨時專利申請的優先權。關于聯邦政府資助研究的聲明本申請是在美國國立衛生研究院提供的合同號為GM086703的政府資助下進行。政府對本申請享有一定權利。專利技術背景去乙酰化酶(Sirtuin)是一類稱為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依賴性去乙酰基酶的酶。人類有七種sirtuin，Sirt1-7，其調控多種生物學過程，包括衰老、轉錄和代謝。因此，能夠調節sirtuin活性的小分子可以用于治療若干人類疾病。在這七種人類sirtuin中，Sirt6特別重要，因為其作用為調控代謝和基因組的穩定性。Sirt6的生物學功能使其有望成為治療脂肪肝疾病、肥胖癥和糖尿病的靶點。因而，能夠活化、抑制或以其他方式調節Sirt6的小分子將在治療此類疾病和狀況中非常有益。瘧疾寄生蟲惡性瘧原蟲含有兩個sirtuin，PfSir2a和PfSir2b。已知這些sirtuin調控致病基因的表達、抗原變異和抗原基因的表達，其有助于瘧疾寄生蟲逃避宿主免疫系統的檢測。因而，能夠抑制或以其他有益方式調節這些sirtuin的小分子能夠用于治療瘧疾，這也將是非常有益的。Sirt6和PfSir2a抑制物的研發受到缺乏對Sirt6和PfSir2a有效的活性分析特別是能夠用于高通量篩選的方法的阻礙。研發有效的Sirt6和PfSir2a活性分析的這種困難主要是由Sirt6和PfSir2a的去乙酰基酶活性非常弱造成的。在這七種哺乳動物sirtuin中，Sirtuin4-7具有較弱的或不具有去乙酰基酶活性。已知Sirt6的功能為是組蛋白H3K9-和H3K56-特異性去乙酰基酶，因為其他酰基肽不能被Sirt6水解。然而，去乙酰基酶的活性非常弱，迄今為止尚無kcat和Km檢測的報告。類似地，已知PfSir2a的去乙酰基酶活性比人Sirt1弱得多。專利技術簡述本申請發現了當賴氨酸上的酰基基本上是疏水的，特別是當酰基含有較高碳原子數(例如，至少5、6、7、8、9、10或更高的碳原子數)的烴基如長鏈烷基或烯基時，Sirt6是酰基-賴氨酸殘基的選擇性去酰基酶。Sirt6的這種選擇性活性與已知的其他sirtuin的選擇性形成鮮明對比。例如，Sirtuin1、2和3已知具有強勁的去乙酰酶活性，而Sirtuin5已知能夠容易地從賴氨酸殘基上除去丙二酰基、琥珀酰基和戊二酰基。相反地，本申請發現了與其去乙酰基酶活性相比，Sirt6明顯能夠更加有效地(例如，有效性超過30倍以上)從賴氨酸殘基上除去長鏈疏水性脂肪酰基。與Sirt6類似，人們發現PfSir2a和Sir7的去乙酰基酶活性也非常弱，但其能夠更高效地除去長鏈脂肪酰基。利用Sirt6這種新發現的活性，本申請描述了一種方法，該方法能夠在不同條件下和存在任意多種可能的Sirt6調節物的情況下，有效測定Sirt6(和具有類似活性的sirtuin，如PfSir2a和Sirt7)的活性水平。因此，盡管通過觀察去酰基酶的活性幾乎無法測定Sirt6、PfSir2a或Sirt7的活性水平或鑒定其調節物(即，調控物，包括活化物或抑制物)，但是本申請已發現了一種通過引入含有長鏈脂肪酰賴氨酸結構的底物測定Sirt6、PfSir2a或Sirt7的活化水平或鑒定其調節物(即，調控物，包括活化物或抑制物)以及測定不同條件下Sirt6-、PfSir2a-或Sirt7-介導酰基水解的效能的有效方法。本申請描述的方法還能有利地用于對能夠調節Sirt6、PfSir2a或Sirt7活性的小分子進行高通量篩選。通過本申請描述的方法鑒定的Sirt6-、PfSir2a-或Sirt7-特異性調節物能夠用于治療或預防多種以Sirt6、PfSir2a或Sirt7活性異常或處于非最佳狀態為特征的多種疾病。這些疾病包括與代謝(例如，肥胖癥)、糖尿病、瘧疾和基因組穩定性相關的那些疾病。本申請還發現哺乳動物的組蛋白具有長鏈脂肪酰基賴氨酸修飾，Sirt6的生理學作用可能是除去這些脂肪酰基修飾。因此，Sirt6可能能夠通過除去組蛋白上的修飾來調控某些基因的轉錄，這提示了組蛋白賴氨酸長鏈脂肪酰化是參與轉錄調控的新型表觀遺傳學修飾。盡管短鏈脂肪酰修飾如乙酰化能夠調控轉錄是公知的，但是長鏈脂肪酰化如在組蛋白上的豆蔻酰化參與表觀遺傳學修飾迄今為止仍是未知的。由于轉錄調控對正常和病變細胞均很重要，因而所述的新型表觀遺傳學修飾能夠有針對性地治療多種疾病。更具體地，用于鑒定Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性調節物的方法(即，分析)包括：(i)在Sirt6、PfSir2a或Sirt7使底物去酰基的條件下，在存在候選化合物的情況下將酰基化的底物與Sirt6、PfSir2a或Sirt7接觸以提供去酰基的底物，其中所述酰基化的底物含有酰基-賴氨酸部分和指示物部分，所述酰基含有至少三個、四個或五個通過碳-碳鍵連接的碳原子的烴基，其中所述烴基任選地包括一個選自O、N和S的雜原子，所述雜原子打斷所述烴基的碳-碳鍵或者取代所述烴基中的碳原子，但是所述雜原子為OH、SH或NH2基團形式的不包括在內，并且其中在所述烴基中的一個或多個氫原子任選地被氟原子取代，以及其中所述賴氨酸的側鏈ε-氨基丁基基團可以衍生化；(ii)將去酰基的底物與裂解試劑接觸，所述裂解試劑裂解所述賴氨酸和指示物部分之間的連接以釋放所述指示物部分并產生具有信號強度的可檢測信號；以及(iii)將所述信號強度與Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性相關聯；其中通過存在所述候選化合物的條件下的Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性相對于不存在所述候選化合物的條件下的Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性的變化，將所述候選化合物鑒定為Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性的調節物。候選化合物可以是在上文所述的分析中檢測的任意化學物質(例如，分子或大分子，如蛋白或核酸)。依據分析結果，可以確定候選化合物是否是Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性的調節物(例如，抑制物或活化物)。在特定實施方式中，候選化合物或調節物具有下述化學結構：在上述式(1)中，R1是具有至少三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個通過碳-碳鍵連接本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種鑒定Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性調節物的方法，所述方法包括：在Sirt6、PfSir2a或Sirt7使底物去酰基的條件下，在存在候選化合物的情況下將酰基化的底物與Sirt6、PfSir2a或Sirt7接觸以提供去酰基的底物，其中所述酰基化的底物含有酰基?賴氨酸部分和指示物部分，所述酰基含有至少三個通過碳?碳鍵連接的碳原子的烴基，其中所述烴基任選地包括一個選自O、N和S的雜原子，所述雜原子打斷所述烴基的碳?碳鍵或者取代所述烴基中的碳原子，但是所述雜原子為OH、SH或NH2基團形式的不包括在內，并且其中在所述烴基中的一個或多個氫原子任選地被氟原子取代，以及其中所述賴氨酸的側鏈ε?氨基丁基基團可以衍生化；將去酰基的底物與裂解試劑接觸，所述裂解試劑裂解所述賴氨酸和指示物部分之間的連接以釋放所述指示物部分并產生具有信號強度的可檢測信號；以及將所述信號強度與Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性相關聯；其中通過存在所述候選化合物的條件下的Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性相對于不存在所述候選化合物的條件下的Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性的變化，將所述候選化合物鑒定為Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性的調節物；其中所述酰基化的底物具有下述化學結構：其中R7是具有至少五個通過碳?碳鍵連接的碳原子的烴基，其中所述烴基任選地包括一個選自O、N和S的雜原子，所述雜原子打斷所述烴基的碳?碳鍵或者取代所述烴基中的碳原子，但是所述雜原子為OH、SH或NH2基團形式的不包括在內，以及其中在所述烴基中的一個或多個氫原子任選地被氟原子取代；R8選自S、NR13和O，其中R13是氫原子或烴基R；X4、X5和X6獨立地選自?(CH2)n?、?NR14?、?O?、?S?或鍵，其中R14是氫原子或烴基R，以及其中n表示1、2或3；R11是氫原子或烴基R；R9和R10獨立地為氫原子或烴基R，其中R10還可以是OH或SH，以及其中R9和R10中的至少一個是指示物部分；其中所述烴基R獨立地為未取代的或者被一個或多個選自N、O、S、P和F的雜原子或含有一個或多個所述雜原子的雜原子基團所取代。...

【技術特征摘要】
2010.12.22 US 61/426,2311.一種鑒定Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性調節物的方法，所述方法包括：
在Sirt6、PfSir2a或Sirt7使底物去酰基的條件下，在存在候選化合物的情況下將酰
基化的底物與Sirt6、PfSir2a或Sirt7接觸以提供去酰基的底物，其中所述酰基化的底物含
有酰基-賴氨酸部分和指示物部分，所述酰基含有至少三個通過碳-碳鍵連接的碳原子的烴
基，其中所述烴基任選地包括一個選自O、N和S的雜原子，所述雜原子打斷所述烴基的
碳-碳鍵或者取代所述烴基中的碳原子，但是所述雜原子為OH、SH或NH2基團形式的不
包括在內，并且其中在所述烴基中的一個或多個氫原子任選地被氟原子取代，以及其中所
述賴氨酸的側鏈ε-氨基丁基基團可以衍生化；
將去酰基的底物與裂解試劑接觸，所述裂解試劑裂解所述賴氨酸和指示物部分之間
的連接以釋放所述指示物部分并產生具有信號強度的可檢測信號；以及
將所述信號強度與Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性相關聯；
其中通過存在所述候選化合物的條件下的Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性相對
于不存在所述候選化合物的條件下的Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性的變化，將所述
候選化合物鑒定為Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性的調節物；
其中所述酰基化的底物具有下述化學結構：
其中R7是具有至少五個通過碳-碳鍵連接的碳原子的烴基，其中所述烴基任選地包括一個
選自O、N和S的雜原子，所述雜原子打斷所述烴基的碳-碳鍵或者取代所述烴基中的碳
原子，但是所述雜原子為OH、SH或NH2基團形式的不包括在內，以及其中在所述烴基
中的一個或多個氫原子任選地被氟原子取代；
R8選自S、NR13和O，其中R13是氫原子或烴基R；
X4、X5和X6獨立地選自-(CH2)n-、-NR14-、-O-、-S-或鍵，其中R14是氫原子或烴基R，
以及其中n表示1、2或3；
R11是氫原子或烴基R；
R9和R10獨立地為氫原子或烴基R，其中R10還可以是OH或SH，以及其中R9和R10中
的至少一個是指示物部分；
其中所述烴基R獨立地為未取代的或者被一個或多個選自N、O、S、P和F的雜原子或
含有一個或多個所述雜原子的雜原子基團所取代。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述酰基-賴氨酸部分連接至至少一個其他的氨
基酸，以及所述指示物部分通過肽鍵共價連接至所述賴氨酸或至少一個其他的氨基酸。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述裂解試劑是蛋白水解酶。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述指示物部分是熒光團。
5.根據權利要求4所述的方法，其中由于所述熒光團的裂解和釋放，所述熒光團改變
其發射波長。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述候選化合物具有下述化學結構：
其中R1是具有至少三個通過碳-碳鍵連接的碳原子的烴基，其中所述烴基任選地包括一個
選自O、N和S的雜原子，所述雜原子打斷所述烴基的碳-碳鍵或者取代所述烴基中的碳
原子，但是所述雜原子為OH、SH或NH2基團形式的不包括在內，并且其中在所述烴基
中的一個或多個氫原子任選地被氟原子取代；
R2選自S、NR6和O，其中R6是氫原子或烴基R；
X1、X2和X3獨立地選自-(CH2)n-、-NR12-、-O-、-S-或鍵，其中R12是氫原子或烴基R，
以及其中n表示1、2或3；
R5是氫原子或烴基R；
R3和R4獨立地是氫原子或烴基R；
其中所述烴基R獨立地為未取代的或者被一個或多個選自N、O、S、P和F的雜原子或
含有一個或多個所述雜原子的雜原子基團所取代，其中R4可以是OH或SH。
7.根據權利要求6所述的方法，其中所述R1的烴基具有至少三個通過碳-碳鍵連接的
碳原子且不存在雜原子取代，但是一個或多個氫原子任選地被氟原子所取代。
8.根據權利要求6所述的方法，其中所述R1的烴基具有至少6個通過碳-碳鍵連接的
碳原子，其中所述烴基任選地包括一個選自O、N和S的雜原子，所述雜原子打斷所述烴
基的碳-碳鍵或者取代所述烴基中的碳原子，但是所述雜原子為OH、SH或NH2基團形式
的不包括在內，以及其中在所述烴基中的一個或多個氫原子任選地被氟原子取代。
9.根據權利要求6所述的方法，其中所述R1的烴基具有至少7個通過碳-碳鍵連接的
碳原子，其中所述烴基任選地包括一個選自O、N和S的雜原子，所述雜原子打斷所述烴
基的碳-碳鍵或者取代所述烴基中的碳原子，但是所述雜原子為OH、SH或NH2基團形式
的不包括在內，以及其中在所述烴基中的一個或多個氫原子任選地被氟原子取代。
10.根據權利要求6所述的方法，其中所述R1的烴基具有至少8個通過碳-碳鍵連接的
碳原子，其中所述烴基任選地包括一個選自O、N和S的雜原子，...

【專利技術屬性】
技術研發人員：林合寧，
申請(專利權)人：康奈爾大學，
類型：發明
國別省市：美國;US