面積歸一化法測定西紅花藥材中西紅花苷類成分的方法技術

本發明專利技術公開了一種面積歸一化法測定西紅花藥材中西紅花苷類成分的方法，建立了西紅花藥材質量控制方法，分離出12個主要的西紅花苷類成分，以相對穩定、價廉的西紅花苷?Ⅰ為內參物，采用面積歸一化法對西紅花藥材中西紅花總苷進行含量測定，解決HPLC法測定西紅花藥材時多個西紅花苷類成分的分離以及含量測定時多個西紅花苷對照品不易獲得的問題。以西紅花苷?Ⅰ為內參物，建立了西紅花苷?Ⅰ對西紅花苷?Ⅱ的相對校正因子，利用相對校正因子計算西紅花苷?Ⅱ的含量；并與藥典采用的外標法測定的32批西紅花中西紅花苷?Ⅰ和Ⅱ含量進行比較，以驗證一測多評法的可行性。解決了藥典測定方法中西紅花苷?Ⅱ對照品性質不穩定、價格昂貴的問題。

Method for determination of saffron and western area safflower glycosides normalization method

The invention discloses a method for the determination of saffron and safflower glycosides in an area normalization method, establish the quality control method of saffron, isolated from the 12 main components of Crocins, to I crocin relatively stable and inexpensive as the internal reference, the Chinese and Western Red saffron total glycosides content determination by area normalization method, solve the separation and determination of HPLC determination of saffron multi glycoside content of saffron and a plurality of crocin control is not easy to get the problem. West of saffloside 1 as the internal reference, set up relative correction factor of crocin crocin II, the content of relative correction factor calculation of crocin II; and the international pharmacopoeia standard method for the determination of the 32 batch of Chinese saffron saffloside I and II were compared to verify the feasibility QAMs method. To solve the determination method of saffloside Chinese Pharmacopoeia II control nature unstable and expensive problem.

【技術實現步驟摘要】
面積歸一化法測定西紅花藥材中西紅花苷類成分的方法
本專利技術涉及中藥活性成分分析
，具體地說，是涉及一測多評法與面積歸一化法相結合的測定西紅花藥材中西紅花苷類成分的方法。
技術介紹
西紅花(CrocussativusL.)又稱藏紅花，僅以雌蕊上部三根紅色柱頭入藥，人工采摘100000-150000朵花才能獲得一公斤藏紅花干品，因此價格昂貴，為名貴中藥材，具有活血化瘀、涼血解毒、解郁安神之功效。主要有效成分為西紅花苷(crocins)，是一種紅色的水溶性胡蘿卜素類化合物，是西紅花酸與葡萄糖或龍膽二糖結合而成的一系列酯苷類，目前已分離得到苷元均為西紅花酸的16種不同順反異構體的西紅花苷。世界各地不同來源西紅花中均以西紅花苷-Ⅰ含量最高，其次為西紅花苷-Ⅱ，西紅花苷產地栽培、干燥與儲存等對西紅花苷含量影響很大，因此在西紅花生產加工和質量控制方面均需要適當的藏紅花苷含量測定方法，《中國藥典》2015年版以西紅花苷中的西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ為指標對西紅花質量控制，要求兩者總含量不低于10％，但西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ在某些樣品中只占各西紅花總苷的70％左右，且隨著儲存時間的增加，反式的西紅花-Ⅰ和苷-Ⅱ會發生降解或異構化，部分轉為其他順式異構體，而西紅花苷口服給藥后，所有西紅花苷均會水解為苷元西紅花酸被吸收入血起效，因此西紅花總苷含量的高低對藥效的影響更大，《中國藥典》根據西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ的總含量為標準，不能全面反映西紅花藥材質量；西紅花在國際上主要用作色素和香料，作為食品添加劑的國際標準ISO3632-2(2010版)，用分光光度法于λmax440nm測定西紅花水提取液的色價來進行質量控制與分級，規定西紅花苷色價大于190為一級品，該方法更不能精確定量西紅花苷含量。因此，《中國藥典》及國際標準ISO3632-2對藏紅花質量評價的標準均需進一步完善，需要建立適合生產加工和質量控制的西紅花總苷含量測定方法。一般認為分光光度法特征性不強，但西紅花是一味很特殊的藥材，藥效成分均集中于柱頭，含量高且相對簡單，主要只有藏紅花苷、藏花醛和苦藏花素三類成分，在可見光區440nm處只有西紅花苷類有吸收，其他成分無干擾，用可見分光光度法(440nm)測定總西紅花苷含量的方法，方法簡便，易于推廣，但該方法只適合生產加工者使用，若有人為摻假等行為，則不適合使用。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是針對《中國藥典》僅測定西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ含量，不能全面體現總西紅花苷的真實含量，《國際標準》測定的總西紅花苷色價不能量化總西紅花苷的含量的缺點。本專利技術將一測多評測定的兩種西紅花苷含量和面積歸一化法測定的總西紅花苷含量相結合，實現了一個對照品完成各西紅花苷類成分的含量測定，降低了檢測成本，并能全面評價西紅花的質量，為西紅花藥材質量評價方法的完善提供了更好的技術參考。本專利技術采用高效液相法，通過優選色譜條件，波長切換等技術測定藥材中的西紅花苷，可分離大部分西紅花苷類成分，但西紅花苷的苷元由七個共軛雙鍵組成，易氧化不穩定，因此西紅花苷對照品價格昂貴，精確定量所有西紅花苷類成分含量，檢測成本非常昂貴，本專利技術使用采用面積歸一化法(ANM)對西紅花藥材中西紅花總苷進行含量測定，解決了HPLC法含量測定時多個西紅花苷對照品不易獲得的問題。本專利技術以西紅花苷-Ⅰ為內參物，建立了西紅花苷-Ⅰ對西紅花苷-Ⅱ的相對校正因子，利用相對校正因子計算西紅花苷-Ⅱ的含量(一測多評)；并與藥典采用的外標法測定的32批西紅花中西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ含量進行比較，以驗證一測多評法的可行性。結果西紅花苷-Ⅰ相對西紅花苷-Ⅱ的相對校正因子重復性好，西紅花中西紅花苷-Ⅱ的一測多評法的計算值與藥典外標法測定結果基本一致，解決了藥典測定方法中西紅花苷-Ⅱ對照品性質不穩定、價格昂貴的問題。為解決上述技術問題，本專利技術提供了一種面積歸一化法測定西紅花藥材中西紅花苷類成分的方法，包括步驟：a.確定色譜條件；b.制備對照品溶液：混合對照品溶液：精密稱取西紅花苷-Ⅰ對照品和西紅花苷-Ⅱ對照品，置于棕色量瓶中，用稀乙醇溶解并定容至刻度，得混合對照品溶液，搖勻，備用；西紅花苷-Ⅰ對照品溶液：精密稱取西紅花苷-Ⅰ對照品置棕色量瓶中，用稀乙醇溶解并定容至刻度，得西紅花苷-Ⅰ對照品溶液；c.制備供試品溶液：參照中國藥典2015年版西紅花項下，精密稱取西紅花樣品粉末，置于棕色量瓶中，加稀乙醇40mL，冰浴超聲處理20min，放置室溫，加乙醇定容至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，取續濾液，得供試品溶液；d.根據2015年版中國藥典的外標法定量西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ的含量；e.一測多評法QMSA測定西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ的含量；f.紫外分光光度法測定總西紅花苷的含量；g.面積歸一化法測定總西紅花苷的含量。優選地，所述步驟a中，色譜條件為UltimateXBC18色譜柱，色譜柱為250mm×4.6mm,5μm；柱溫：30℃；流動相：水-甲醇，梯度洗脫，0-60min，甲醇：20％-100％；DAD檢測器波長范圍200-600nm，檢測波長440nm，流速：1.0mL·min-1；進樣量：10μL。優選地，所述步驟c中，所述冰浴超聲為250W、40KHz處理20min。優選地，所述步驟c中，微孔濾膜的孔徑為0.22μm。優選地，所述步驟d，進一步為，取步驟b中西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ的混合對照品溶液1、2、4、8、10、20μL，按步驟a中色譜條件進樣分析，測定峰面積，分別以西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ質量濃度(X,μg)對其相應峰面積(Y)進行線性回歸，得回歸方程，精密量取步驟c中的供試品溶液10μL，注入液相色譜儀測定，相應峰面積代入回歸方程計算苷-Ⅰ和苷-Ⅱ含量。優選地，所述步驟e，進一步為，取步驟b中混合對照品溶液，分別進樣1、2、4、8、10、15、20μL，記錄峰面積，應用多點校正法，以西紅花苷-Ⅰ為內參物，計算西紅花苷-Ⅰ對西紅花苷-Ⅱ的相對校正因子fk/s，fk/s計算公式：fk/s＝(Cs×Ak)/(Ck×As)，待測成分(西紅花苷-Ⅱ)質量濃度計算公式：Ck′＝(Cs×Ak′)/(fk/s×As)，其中Cs為內參物(西紅花苷-Ⅰ)質量濃度，As為內參物色譜峰峰面積，Ck為西紅花苷-Ⅱ對照品質量濃度，Ak為西紅花苷-Ⅱ對照品色譜峰峰面積，Ck′為西紅花樣品中西紅花苷-Ⅱ質量濃度，Ak′為西紅花樣品中西紅花苷-Ⅱ色譜峰峰面積。優選地，所述步驟f，進一步為，精密吸取西紅花苷-Ⅰ對照品溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL置于10mL量瓶中，用稀乙醇稀釋至刻度，以稀乙醇作空白對照，采用紫外-可見分光光度法，于440nm波長處測定吸光度，得標準曲線；精密吸取步驟c中的供試品溶液5mL，置50mL棕色量瓶中，用稀乙醇稀釋至刻度，用可見分光光度法于440nm波長處測定吸光度，以西紅花苷-Ⅰ為對照標準品，按標準曲線計算總西紅花苷含量。優選地，所述步驟g，進一步為，稱取西紅花樣品粉末約10mg，精密稱定，置50mL棕色量瓶中，加稀乙醇40mL，冰浴超聲(250W，40KHz)處理20min，放置室溫，加乙醇定容至刻度，搖勻，0.22μm微孔濾膜濾過，精密吸取續濾液及步驟b中對照品溶液各10μL，注入液相本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種面積歸一化法測定西紅花藥材中西紅花苷類成分的方法，其特征在于，包括步驟：a.確定色譜條件；b.制備對照品溶液：混合對照品溶液：精密稱取西紅花苷?Ⅰ對照品和西紅花苷?Ⅱ對照品，置于棕色量瓶中，用稀乙醇溶解并定容至刻度，得混合對照品溶液，搖勻，備用；西紅花苷?Ⅰ對照品溶液：精密稱取西紅花苷?Ⅰ對照品置棕色量瓶中，用稀乙醇溶解并定容至刻度，得西紅花苷?Ⅰ對照品溶液；c.制備供試品溶液：參照中國藥典2015年版西紅花項下，精密稱取西紅花樣品粉末，置于棕色量瓶中，加稀乙醇40mL，冰浴超聲處理20min，放置室溫，加乙醇定容至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，取續濾液，得供試品溶液；d.根據2015年版中國藥典的外標法定量西紅花苷?Ⅰ和苷?Ⅱ的含量；e.一測多評法QMSA測定西紅花苷?Ⅰ和苷?Ⅱ的含量；f.紫外分光光度法測定總西紅花苷的含量；g.面積歸一化法測定總西紅花苷的含量。

【技術特征摘要】
1.一種面積歸一化法測定西紅花藥材中西紅花苷類成分的方法，其特征在于，包括步驟：a.確定色譜條件；b.制備對照品溶液：混合對照品溶液：精密稱取西紅花苷-Ⅰ對照品和西紅花苷-Ⅱ對照品，置于棕色量瓶中，用稀乙醇溶解并定容至刻度，得混合對照品溶液，搖勻，備用；西紅花苷-Ⅰ對照品溶液：精密稱取西紅花苷-Ⅰ對照品置棕色量瓶中，用稀乙醇溶解并定容至刻度，得西紅花苷-Ⅰ對照品溶液；c.制備供試品溶液：參照中國藥典2015年版西紅花項下，精密稱取西紅花樣品粉末，置于棕色量瓶中，加稀乙醇40mL，冰浴超聲處理20min，放置室溫，加乙醇定容至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，取續濾液，得供試品溶液；d.根據2015年版中國藥典的外標法定量西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ的含量；e.一測多評法QMSA測定西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ的含量；f.紫外分光光度法測定總西紅花苷的含量；g.面積歸一化法測定總西紅花苷的含量。2.如權利要求1所述的面積歸一化法測定西紅花藥材中西紅花苷類成分的方法，其特征在于，所述步驟a中，色譜條件為UltimateXBC18色譜柱，色譜柱為250mm×4.6mm,5μm；柱溫：30℃；流動相：水-甲醇，梯度洗脫，0-60min，甲醇：20％-100％；DAD檢測器波長范圍200-600nm，檢測波長440nm，流速：1.0mL·min-1；進樣量：10μL。3.如權利要求1所述的面積歸一化法測定西紅花藥材中西紅花苷類成分的方法，其特征在于，所述步驟c中，所述冰浴超聲為250W、40KHz處理20min。4.如權利要求1所述的面積歸一化法測定西紅花藥材中西紅花苷類成分的方法，其特征在于，所述步驟c中，微孔濾膜的孔徑為0.22μm。5.如權利要求1所述的面積歸一化法測定西紅花藥材中西紅花苷類成分的方法，其特征在于，所述步驟d，進一步為，取步驟b中西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ的混合對照品溶液1、2、4、8、10、20μL，按步驟a中色譜條件進樣分析，測定峰面積，分別以西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ質量濃度(X,μg)對其相應峰面積(Y)進行線性回歸，得回歸方程，精密量取步驟c中的供試品溶液10μL，注入液相色譜儀測定，相應峰面積代入回歸方程計算苷-Ⅰ和苷-Ⅱ含量。6.如權利要求1所述的面積歸一化法測定西紅花藥材中西紅花苷類成分的方法，其特征在于，所述步驟e，進一步為，取步驟b中混合對照品溶液，分別進樣1、...

【專利技術屬性】
技術研發人員：錢曉東，周桂芬，姚沖，袁玉梅，李麗琴，余靜芬，
申請(專利權)人：湖州市中心醫院，
類型：發明
國別省市：浙江,33