一種以多表位肽段組合抗原刺激免疫系統產生抗體的方法技術方案

本發明專利技術公開了一種以多表位肽段組合抗原刺激免疫系統產生抗體的方法，屬于生物技術、特異性抗體檢測和疫苗制備領域。本發明專利技術應用肽段組合的方式，由幾個重要的小肽的合成來替代原病原微生物，會更為純凈，相應的副反應較小，免疫針對性相比于完整的病原微生物要好。

A method for producing antibodies by stimulating the immune system by combining antigenic epitopes of multiple epitopes

The invention discloses a method for stimulating an immune system to produce antibodies by combining epitopes with peptide epitopes, belonging to the field of biotechnology, specific antibody detection and vaccine preparation. The application of peptide combinations by the synthesis of several important peptides to replace the primary pathogenic microorganisms will be more pure, less side effects of immune to pathogenic microorganisms is better compared to the complete.

【技術實現步驟摘要】
一種以多表位肽段組合抗原刺激免疫系統產生抗體的方法
本專利技術涉及一種以多表位肽段組合抗原刺激免疫系統產生抗體的方法，屬于生物技術、特異性抗體檢測和疫苗制備領域。
技術介紹
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒感染所致。HBV顆粒由乙肝表面抗原(HBsAg)和來自宿主的脂質組成，是直徑約為42nm的球形結構。HBsAg包括3種被膜糖蛋白，即大蛋白(LHBs)、中蛋白(MHBs)和小蛋白(SHBs)。乙肝病毒大分子蛋白表面又分為前S1區、前S2區和S區。有研究表明，PreS1只存在于表面抗原的大分子蛋白中，是乙肝早期診斷和病毒復制的指標，在病毒顆粒的裝配和感染中起重要作用；目前最受關注的兩個重要表位：第21-47號氨基酸所在的表位(簡稱P21表位)和第94-117號氨基酸所在的表位(簡稱P94表位)，存在病毒與肝細胞膜的結合位點。根據HBV全基因組序列差別>8％將HBV分為A-I九個基因型，根據S基因的差別>4％可將HBV基因型分為20個亞型。目前，國際上已經存在不同基因型的參照序列以及以此為依據建立了多種基因型檢測方法，但這些參照株多為單一患者來源，本身就存在多種堿基替代情況，且不同地區的相同基因型或亞型間還有較大差異，對于不同地區需建立相應適合的參照序列，這對于具體研究時所用的多肽序列選擇造成了很大的困難。目前，多肽主要通過化學合成和生物合成制備得到，其中多肽的化學合成有液相合成和固相合成之分，每種多肽合成方法應用方式不同且各有利弊。對于小片段多肽的合成(30個氨基酸以內，少數為50個氨基酸以內)多采用固相逐步合成方法，該方法精準和有針對性，但隨著氨基酸數量的增加，合成效率逐步下降，非目的肽含量逐步增長，目的肽的純度相應降低，后續的純化和重復性愈加困難。對于大片段多肽(含100個以上氨基酸)目前大多應用液相分段合成法，原理是根據多肽片段在溶液中的專一性或化學選擇性，自發連接成長肽，但步驟繁瑣，不易合成，且精準度和針對性有待完善。疫苗是將病原微生物(如細菌、立克次氏體、病毒等)及其代謝產物，經過人工減毒、滅活或利用基因工程等方法制成的用于預防傳染病的自動免疫制劑。目前疫苗的制備仍不完善，不同人群接種疫苗后會產生不同程度的副反應，效果不穩定。
技術實現思路
為了解決同一基因型的抗原肽段復雜多變或者抗原突變株增生，大片段多肽合成較困難的現狀，以及目前疫苗存在的效果不穩定的問題，本專利技術提供一種多表位肽段組合抗原，以及以組合抗原刺激免疫系統產生抗體的方法。本專利技術應用肽段組合的方式，由幾個重要的小肽的合成來替代原病原微生物，會更為純凈，相應的副反應較小，免疫針對性相比于完整的病原微生物要好。本專利技術的第一個目的是提供了一種組合抗原，所述組合抗原是將多個表位肽段組合而得到的抗原。在本專利技術的一種實施方式中，所述組合抗原，是用于檢測乙肝病毒PreS1抗體、乙肝病毒PreS2抗體、甲肝病毒VP1抗體、甲肝病毒VP3抗體、丙肝病毒E2抗體等。在本專利技術的一種實施方式中，所述組合抗原，是用于檢測抗乙型肝炎病毒抗體的組合抗原。在本專利技術的一種實施方式中，所述表位，包括乙肝病毒PreS1抗體的P21表位、P94表位，PreS2抗體的120-145號氨基酸表位；甲肝VP1抗體的11-25號氨基酸表位、VP3抗體的102-121號氨基酸表位；丙肝病毒E2抗體的384-410號氨基酸表位、412-423號氨基酸表位、523-535號氨基酸表位等。在本專利技術的一種實施方式中，所述組合抗原包含氨基酸序列為SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的肽段。在本專利技術的一種實施方式中，所述氨基酸序列為SEQIDNO.1的肽段即為P21表位的肽段；氨基酸序列為SEQIDNO.2的肽段即為P94表位的肽段。在本專利技術的一種實施方式中，所述組合抗原是將序列為SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的肽段分別偶聯大蛋白后，將偶聯后的復合物混合得到的。在本專利技術的一種實施方式中，所述大蛋白可以是KLH、OVA、BSA等中的任意一種。在本專利技術的一種實施方式中，所述組合抗原中氨基酸序列為SEQIDNO.1、SEQIDNO.2的肽段的摩爾比在1:10～10:1之間。本專利技術的第二個目的是提供一種以組合抗原刺激免疫系統產生特異性抗體的方法，所述方法是以多表位肽段組合的方式代替全長肽段作為抗原刺激免疫系統產生特異性抗體。在本專利技術的一種實施方式中，所述方法，是采用兩個以上表位的肽段，分別偶聯大蛋白，然后以偶聯有大蛋白的兩個以上的肽段作為抗原。在本專利技術的一種實施方式中，所述特異性抗體是指乙肝病毒PreS1抗體、乙肝病毒PreS2抗體、甲肝病毒VP1抗體、甲肝病毒VP3抗體、丙肝病毒E2抗體等。在本專利技術的一種實施方式中，所述表位，包括乙肝病毒PreS1抗體的P21表位、P94表位，PreS2抗體的120-145號氨基酸表位；甲肝VP1抗體的11-25號氨基酸表位、VP3抗體的102-121號氨基酸表位；丙肝病毒E2抗體的384-410號氨基酸表位、412-423號氨基酸表位、523-535號氨基酸表位等。在本專利技術的一種實施方式中，所述肽段包括氨基酸序列為SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的肽段。在本專利技術的一種實施方式中，所述氨基酸序列為SEQIDNO.1的肽段即為P21表位的肽段；氨基酸序列為SEQIDNO.2的肽段即為P94表位的肽段。在本專利技術的一種實施方式中，所述兩個以上的肽段，各肽段相互之間的摩爾比在1:10～10:1之間。在本專利技術的一種實施方式中，所述大蛋白可以是KLH、OVA、BSA等中的任意一種。本專利技術的有益效果：本專利技術應用肽段組合的方式，由幾個重要的小肽的合成來替代原病原微生物，會更為純凈，相應的副反應較小，免疫針對性相比于完整的病原微生物要好。附圖說明圖1：不同包被方式抗體檢測吸光度值及顯著性圖；圖2：包被P21&P94-KLH與PreS1全長的抗體檢測吸光度值圖；圖3：包被P21-KLH、P94-KLH與PreS1全長的抗體檢測吸光度值圖圖4：包被P21&P94-KLH與PreS1全長的抗體檢測吸光度值顯著性圖；圖5：包被P21-KLH與PreS1全長的抗體檢測吸光度值顯著性圖；圖6：包被P94-KLH與PreS1全長的抗體檢測吸光度值顯著性圖。具體實施方案下面結合附圖，通過對本專利技術較佳實施方式，即通過以B基因型為例兩表位肽段組合代替全長檢測乙型肝炎病毒前S1抗體來具體說明本專利技術方法，但不限制本專利技術。實施例1：通過兩表位肽段組合代替全長的方式檢測抗乙型肝炎病毒前S1抗體間接ELISA方法檢測HBV患者血清中抗體濃度，其中包被抗原的選擇至關重要。常規ELISA方法需提前確定HBV患者的基因型，根據其選擇合適的包被多肽序列。但是存在兩個問題：第一，目前，HBV分為A-I九個基因型；即便對于同種基因型的參照株，由于地區差異及自身堿基替換等情況，存在多種不同的氨基酸序列，對于研究時選擇何種多肽序列造成了困難；第二，目前對于小片段多肽(少于30個氨基酸)多采用固相合成的方法，易于合成，但隨著氨基酸數量的增加，合成效率逐步下降，后續的純化和重復性愈加困難；大片段多肽(多于100個氨基酸)多采用液相分段合成法，但步驟繁瑣，不易合成，且精準度和針對性有待完善。本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種組合抗原，其特征在于，所述組合抗原是將多個表位肽段組合而得到的抗原。

【技術特征摘要】
1.一種組合抗原，其特征在于，所述組合抗原是將多個表位肽段組合而得到的抗原。2.根據權利要求1所述的組合抗原，其特征在于，所述組合抗原是用于檢測乙肝病毒PreS1抗體、乙肝病毒PreS2抗體、甲肝(HAV)病毒VP1抗體、甲肝病毒VP3抗體或者丙肝(HCV)病毒E2抗體的抗原。3.根據權利要求1所述的組合抗原，其特征在于，所述表位，包括乙肝病毒PreS1抗體的P21表位、P94表位，PreS2抗體的120-145號氨基酸表位；甲肝VP1抗體的11-25號氨基酸表位、VP3抗體的102-121號氨基酸表位；丙肝病毒E2抗體的384-410號氨基酸表位、412-423號氨基酸表位、523-535號氨基酸表位。4.根據權利要求1所述的組合抗原，其特征在于，所述組合抗原包含氨基酸序列為SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的肽段。5.根據權利要求1所述的組合抗原，其特征在于，所述組合抗原是將序列為SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的肽段分別偶聯大蛋白后，將偶聯后的復合物混合得到的。6.根據權利要求1...

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉鎮寧，張曉晨，李家億，李玉敏，章文羿，黃清瑞，溫曉玉，牛俊奇，康新迪，蔡林君，王放，
申請(專利權)人：吉林大學，
類型：發明
國別省市：吉林,22