一種抗腫瘤多肽及其制備方法和用途技術

本發明專利技術公開了一種抗腫瘤多肽及其制備方法和用途，該多肽與谷氨酰轉肽酶(γ?GGT)蛋白的片段第7～19位氨基酸殘基完全匹配，其氨基酸序列如下：VLGLLAVVLVLVI，命名為VI?13。為改善其溶解性，將其序列改構：VLGLRLAVRVLRVLRVI，命名為VI?17。本發明專利技術涉及的多肽是通過固相合成方法獲得的。體內外藥效學實驗結果表明，本發明專利技術的多肽可顯著抑制人肝癌細胞系Hep3B的生長，具有潛在的抗腫瘤藥物開發價值。

【技術實現步驟摘要】
一種抗腫瘤多肽及其制備方法和用途
本專利技術屬于生物醫學
，具體涉及一種多肽的篩選、合成及其應用，本專利技術的多肽具有抗腫瘤活性。
技術介紹
腫瘤仍是威脅人類健康的重要因素，每年約有700萬人死于腫瘤相關疾病。雖然手術和化療能在一定程度上控制病情，但往往不能徹底清除腫瘤細胞，仍有大量病人發生復發和轉移。目前，化療是阻斷腫瘤病情進展的最常用手段。但傳統的化療手段暴露出大量弊端，如特異性差、易出現耐藥性、藥物體內分布差異和藥物清除率等。因此，針對腫瘤的高特異性靶向性藥物的研發悄然興起。長期以來，人們希望通過對腫瘤相關蛋白/多肽及其受體的研究，從而開發出具有高效率和高選擇性的抗腫瘤藥物，目前這一類制劑包括腫瘤相關蛋白、單克隆抗體和多肽。但由于蛋白和單克隆抗體的分子量較大，不易直接作用到腫瘤組織，且兩者都具有一定的肝臟和骨髓毒性，使其應用受到了極大的限制。與前者相比，多肽藥物由于其免疫原性低、受體結合率高、制備成本低且易于改造和聯合應用，逐漸受到腫瘤治療領域的關注。雖然多肽的體內半衰期短，易被蛋白酶降解和肝腎等臟器代謝，但憑借其治療的高效性和特異性，目前已有多種多肽類藥物及其衍生物上市或進入臨床研究階段，其中抗腫瘤藥物有10余種已批準上市。抗腫瘤多肽的來源主要有以下幾種：1.天然來源的抗腫瘤多肽，主要從動物、植物和海洋生物體內分離得到，如來源于牛科動物的乳鐵蛋白LfcinB9肽LTX-302、植物中分離出的新肽psylesA-F等都能針對多種腫瘤發揮抗腫瘤活性；2.肽庫來源的抗腫瘤多肽，其中多數是通過噬菌體展示庫和化學合成肽庫中篩選得到，如噬菌體展示庫中篩選到的CD133特異性結合7肽LS-7能有效抑制結腸癌、乳腺癌等腫瘤細胞的遷移和轉移，人工化學合成多肽如TZT-1027可抑制微管蛋白聚合，使細胞從G2/M期阻滯，促使細胞凋亡。雖然目前抗腫瘤多肽的研究已取得不錯的成績，但幾乎所有的多肽均來源與自然界或是化學合成庫，從人體中分離得到的抗腫瘤多肽鮮有報道，這些多肽可能具有一定的潛在免疫排異反應可能。因此，研究和開發人源性的抗腫瘤多肽將具有更高的特異性和安全性。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種抗腫瘤多肽及其制備方法和應用，該抗腫瘤多肽具有顯著抑制腫瘤細胞活性的生物學效應多肽，具有潛在的抗腫瘤藥物開發價值。本專利技術的技術方案是：一種多肽VI-13，其特征是氨基酸序列如SEQID：No.1所示。一種多肽VI-17，其特征是氨基酸序列如SEQID：No.2所示。一種多肽VI-17，其特征是相關衍生多肽AI-17的氨基酸序列如SEQID：No.3所示。一種多肽VI-17，其特征是相關衍生多肽IV-17的氨基酸序列如SEQID：No.4所示。一種多肽VI-17，其特征是相關衍生多肽VI-7的氨基酸序列如SEQID：No.5所示。一種多肽VI-17，其特征在于該多肽為具有顯著抑制腫瘤細胞活性的生物學效應多肽。一種多肽VI-17，其特征在于該多肽為具有胞漿定位的多肽。一種多肽VI-17，其特征在于在制備抗腫瘤藥物中的應用。該抗腫瘤多肽與谷氨酰轉肽酶(γ-GGT)蛋白的片段第7～19位氨基酸殘基完全匹配，其氨基酸序列如下：VLGLLAVVLVLVI，命名為VI-13。為改善其溶解性，將其序列改構：VLGLRLAVRVLRVLRVI，命名為VI-17。本專利技術人通過對臍帶血清高效色譜篩選和MALDI-TOFMS質譜檢測，鑒定了γ-GGTN端多肽片段VI-13，其序列如SEQID：No.1所示。根據VI-13的序列特征和溶解性進行改構得到VI-17，其序列如SEQID：No.2所示，采用固相化學合成法獲得具有較高抗腫瘤活性的目標多肽。其相關衍生多肽：藥效學實驗表明，多肽VI-17體內外顯著抑制人肝癌細胞Hep3b的生長，表明VI-17可能作為一種抗腫瘤治療的藥物。根據本專利技術，所說的“多肽片段VI-17”也包括本領域技術人員所知的將SEQIDNo.2序列中的氨基酸經過一個或多個氨基酸殘基的取代或添加且具有相同酶活性的由其衍生的多肽或蛋白質，比如在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸，如與載體編碼的氨基酸融合、前導序列、分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列等；一個或多個保守性氨基酸殘基被取代；或成熟多肽與另一化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，如聚乙二醇)融合所形成的多肽；也可以是一個或氨基酸殘基中具有取代基團的多肽。其次，本專利技術還提供上述多肽片段的活性區域的核心部分，其序列如SEQIDNo.3所示。附圖說明圖1是臍帶血的體積排阻色譜(SEC)篩選結果。圖2是目標分子的質譜鑒定結果。圖3是多肽生物學活性的MTT檢測結果。圖4是裸鼠荷瘤實驗體內驗證多肽的抗腫瘤特性。圖5是流式檢測腫瘤細胞死亡。具體實施方式一、多肽篩選和改構血清樣品的制備：收集胎兒臍帶血清約5ml，室溫下靜置30分鐘后，4℃低溫保存4小時后離心(2000r/min、10min)，吸取上層血清置于-80℃保存待用。二維色譜：體積排阻色譜(SEC):將血清樣品用PBS(pH7.4)稀釋10倍，每次進樣100μl。流動相為20mmol·L-1KH2PO4+100mmol·L-1NaCl，pH＝7.0，流速0.5ml·min-1。用紫外檢測儀在280nm進行檢測。按照色譜洗脫曲線進行分段收集，由于SEC分離主要取決于被分離分子的大小，因此血清中第一段組分主要為血清中大分子量蛋白質。本研究主要收集160min-180min和200min-220min后兩段組分，將收集的色譜組分濃縮凍干，見附圖1。反相液相色譜(RPLC)：用150μl超純水融解濃縮凍干的色譜組分。取100μl用C18大孔反相液相色譜柱分離，以CH3OH-H2O-1‰三氟乙酸(TFA)體系為流動相，A液為H2O+1‰TFA，B液為CH3OH+1‰TFA，30min線形梯度洗脫從100％A到100％B，后延長15min。按照色譜洗脫曲線進行分段收集反向液相色譜相關產物，進行質譜鑒定，于質核比2021處檢測到特異性峰，見附圖2。經測序和生物信息學分析，確定該序列為VLGLLAVVLVLVI。二、多肽合成本專利技術多肽均為固相化學合成法獲得，具體步驟如下：多肽固相合成順序一般從C端(羧基端)向N端(氨基端)進行。以Fmoc-Ile-wangregin樹脂為載體,用DCM膨脹后樹脂體積擴大，使其在后面的反應中能和反應溶劑充分接觸；在六氫吡啶DMF溶液的作用下，脫掉氨基的保護基，使第一個氨基酸Fmoc-Ala-OH接到固相載體上。然后氨基被封閉的第二個氨基酸的羧基通過N,Nˊ-二環己基碳二亞胺(DCC，Dicyclohexylcarbodiimide)活化，羧基活化后的的第二個氨基酸再與已接在固相載體的第一個氨基酸的氨基反應形成肽鍵，在固相載體上就生成一個帶有保護基的二肽。依次重復上面的反應步驟，使肽鏈從C端向N端延長，直至達到所需要的肽鏈長度，最后N端合成Fmoc-Ala-OH。反應完成后在六氫吡啶DMF溶液的作用下，脫掉氨基的保護基，最后再次使用DCM膨脹兩次，用乙醚或者甲醇收縮干燥后下肽。三、生物學效應1、VI-17在體外對肝癌細胞系Hep3b生長的影響。細胞活力檢測：用含10％胎牛血清的DMEM培養Hep3本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種多肽VI?13，其特征是氨基酸序列如SEQ?ID：No.1所示。

【技術特征摘要】
1.一種多肽VI-13，其特征是氨基酸序列如SEQID：No.1所示。2.一種多肽VI-17，其特征是氨基酸序列如SEQID：No.2所示。3.根據權利要求書2所述的一種多肽VI-17，其特征是相關衍生多肽AI-17的氨基酸序列如SEQID：No.3所示。4.根據權利要求書2所述的一種多肽VI-17，其特征是相關衍生多肽IV-17的氨基酸序列如SEQID：No.4所示。5.根...

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳勇，白泉，姚雪彪，趙寧，方誠，郭欣，呂行，殷若哲，喬勃偉，李雯慧，宋文杰，何勇，楊雁靈，
申請(專利權)人：陳勇，
類型：發明
國別省市：陜西,61