一種表達(dá)CD19和CD20抗體基因嵌合抗原受體的慢病毒載體及其制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種表達(dá)CD19和CD20抗體基因嵌合抗原受體的慢病毒載體及其制備方法，該慢病毒載體通過將含有CD19和CD20抗體基因嵌合抗原受體基因的穿梭表達(dá)載體與輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，重組收獲及濃縮即形成表達(dá)CD19和CD20抗體基因嵌合抗原受體的慢病毒載體。本發(fā)明專利技術(shù)表達(dá)CD19和CD20抗體基因嵌合抗原受體的慢病毒載體的制備方法具有簡(jiǎn)單易行，耗時(shí)短，重復(fù)性高，所生產(chǎn)的慢病毒具有很高的感染效率，可高效表達(dá)目的基因，且很少引發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，應(yīng)用范圍十分廣泛。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種表達(dá)CD19和CD20抗體基因嵌合抗原受體的慢病毒載體及其制備方法
：本專利技術(shù)涉及醫(yī)學(xué)病毒學(xué)
，具體涉及一種表達(dá)CD19和CD20抗體基因嵌合抗原受體的慢病毒載體及其制備方法。
技術(shù)介紹
：淋巴T細(xì)胞是構(gòu)成細(xì)胞免疫的主要成分，而利用基因工程使T細(xì)胞表達(dá)嵌合抗原受體能使T細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為具有特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞，是一種有前景的腫瘤免疫治療策略。嵌合性抗原受體應(yīng)用的關(guān)鍵是確定一種腫瘤相關(guān)抗原，這種抗原具有在腫瘤細(xì)胞表面過表達(dá)或高表達(dá)，而在正常組織無(wú)表達(dá)或低表達(dá)。CD19是表達(dá)于B淋巴細(xì)胞及濾泡樹突狀細(xì)胞的表面蛋白，屬于免疫球蛋白(Ig)超家族成員，位于16號(hào)染色體短臂上(16p11.2)，編碼556個(gè)氨基酸的Ⅰ型跨膜糖蛋白，分子量95KD。細(xì)胞外有N端及兩個(gè)C2-Ig區(qū)，一個(gè)跨膜區(qū)，細(xì)胞內(nèi)有C端及含9個(gè)酪氨酸殘基的高度保守功能區(qū)，CD19在早期B細(xì)胞的發(fā)育中扮演重要的角色，所有的急性白血病都表達(dá)CD19。CD20是一種磷酸化蛋白質(zhì)分子，分子質(zhì)量約為35kD，屬于4次跨膜的蛋白質(zhì)超家族。它表達(dá)于90％以上的B淋巴瘤細(xì)胞和正常B淋巴細(xì)胞，而在造血干細(xì)胞、原始B淋巴細(xì)胞、正常血細(xì)胞以及其他組織上不表達(dá)。因此，CD19，CD20可作為惡性B淋巴細(xì)胞白血病免疫治療的一種有效的靶抗原。因此，構(gòu)建及表達(dá)靶向CD19和CD20抗體基因崁合抗原受體對(duì)于惡性B淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞免疫治療具有重要臨床前指導(dǎo)意義。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，病毒學(xué)的基因轉(zhuǎn)移方法，被越來越多的應(yīng)用于基因治療。它可以將外源基因?qū)氚ㄊ箢悺㈧`長(zhǎng)類及人在內(nèi)的體細(xì)胞中，并整合到細(xì)胞基因組中，達(dá)到長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)的目的，因而在包括遺傳病治療、移植、干細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)等許多領(lǐng)域的應(yīng)用中有非常好的前景。病毒學(xué)的基因轉(zhuǎn)移載體以逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體最為成熟。常見的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體由小鼠白血病病毒(MLV)改造而來，雖可使目的基因整合至靶細(xì)胞基因組、實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)，但只能轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂細(xì)胞，因此只能用于基因治療的離體方案。腺病毒載體既能轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂細(xì)胞，亦可轉(zhuǎn)導(dǎo)靜止細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率也較高，但目的基因不整合至靶細(xì)胞基因組，僅能短暫表達(dá)，而且腺病毒本身某些抗原的表達(dá)可引起人體免疫反應(yīng)，阻止其重復(fù)轉(zhuǎn)導(dǎo)。近來，一些研究者把目光投向了以Ⅰ型人類免疫缺陷病(HIV-1)為代表的慢病毒。研究表明，以HIV-1為基礎(chǔ)構(gòu)建的慢病毒載體不僅能將目的基因整合至靶細(xì)胞基因組，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，同時(shí)具有可感染非分裂細(xì)胞、免疫反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)，適于體內(nèi)基因治療，因此成為理想的基因轉(zhuǎn)移載體。目前，對(duì)于生產(chǎn)表達(dá)CD19和CD20崁合抗原受體重組慢病毒會(huì)遇到如下問題：1)耗時(shí)長(zhǎng)；2)重復(fù)性低；3)難以轉(zhuǎn)染甚至無(wú)法轉(zhuǎn)染；4)難以達(dá)到目的基因的高效表達(dá)，一些蛋白相關(guān)的功能實(shí)驗(yàn)難以進(jìn)行。與此相對(duì)照，本專利技術(shù)提供的重組慢病毒生產(chǎn)方法具有簡(jiǎn)單易行，重復(fù)性高，所生產(chǎn)慢病毒具有很高的感染效率，且很少引發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，應(yīng)用范圍十分廣泛。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
：本專利技術(shù)的目的在于解決上述的技術(shù)問題，提供一種表達(dá)CD19和CD20抗體基因嵌合抗原受體的慢病毒載體及其制備方法。本專利技術(shù)的目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：一種表達(dá)CD19和CD20抗體基因嵌合抗原受體的慢病毒載體，通過將含有CD19和CD20抗體基因嵌合抗原受體基因的穿梭表達(dá)載體與輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，重組收獲及濃縮即形成表達(dá)CD19和CD20抗體基因嵌合抗原受體的慢病毒載體。具體地，所述表達(dá)CD19和CD20抗體基因嵌合抗原受體的慢病毒載體的制備方法，包括如下步驟：S1：293T細(xì)胞的準(zhǔn)備a.從初始細(xì)胞庫(kù)中復(fù)蘇293T細(xì)胞；b.將復(fù)蘇的293T細(xì)胞懸浮于10％FBSDMEM培養(yǎng)基中，接種于T75培養(yǎng)瓶中置于37℃條件下，5％CO2孵育箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)；其中：所述10％FBSDMEM培養(yǎng)基中含有4.5g/L葡糖糖，1％丙酮酸鈉，1％谷氨酰胺。所述復(fù)蘇的293T細(xì)胞于10％FBSDMEM培養(yǎng)基中按2X104/cm2的接種量接種于T75培養(yǎng)瓶中。c.將培養(yǎng)的293T細(xì)胞每隔3～4天進(jìn)行傳代擴(kuò)增培養(yǎng)一次；所述傳代擴(kuò)增培養(yǎng)的方法，包括以下步驟：a.移走用過的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞一次；b.用0.5％胰蛋白酶37℃消化細(xì)胞3～15min，然后加入與細(xì)胞體積等量的含10％FBS的培養(yǎng)基使胰蛋白酶失活；c.將收集的細(xì)胞離心并重新懸浮于新鮮培養(yǎng)基中，接種于T75/T500/CellStac培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)盤中培養(yǎng)一直到獲得足夠數(shù)量用于轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。所述收集的細(xì)胞按2X104/cm2的接種量接種于T75/T500/CellStac培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)盤中。S2：慢病毒CD19和CD20表達(dá)質(zhì)粒與輔助包裝質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染a.將上述傳代擴(kuò)增的293T細(xì)胞于CellStack培養(yǎng)盤中，2天后當(dāng)細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)盤面積的80％時(shí)開始轉(zhuǎn)染；所述傳代擴(kuò)增的293T細(xì)胞按0.5～1.5X104/cm2的接種量接種于CellStack培養(yǎng)盤中，可根據(jù)所需病毒生產(chǎn)量接種于多個(gè)培養(yǎng)盤中。b.準(zhǔn)備共轉(zhuǎn)染混合物，即根據(jù)CellStack培養(yǎng)盤的用量或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞量的比例進(jìn)行擴(kuò)大或縮減轉(zhuǎn)染，備用；c.按照順序依次加入以下質(zhì)粒和試劑：含有CD19和CD20基因的慢病毒載體，含有水皰性口炎病毒G蛋白基因輔助包裝質(zhì)粒,含有包裝假型病毒顆粒必需的蛋白質(zhì)基因的輔助包裝質(zhì)粒，使質(zhì)粒總量為0.5μg/cm2，并將質(zhì)粒溶于pH7.9的TE緩沖液中；d.加入CaCl2和pH7.2的2XHEPES生理緩沖液(HBS)混勻后，置于室溫下5min～30min；e.移去培養(yǎng)盤中原有的培養(yǎng)基，加入上述備用的共轉(zhuǎn)染混合物和含有2％FBS的DMEM培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)盤置于37℃，5％CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)2～3h；f.移除共轉(zhuǎn)染混合物后，加入含有丁酸鹽的2％FBS的DMEM培養(yǎng)基中，再將培養(yǎng)盤置于37℃，5％CO2孵育箱進(jìn)行培養(yǎng)72h；S3：重組慢病毒收獲及濃縮a.收獲上述培養(yǎng)72h后的重組慢病毒上清，即得粗制慢病毒；b.將收獲的粗制慢病毒上清經(jīng)0.45μm濾器過濾以清除細(xì)胞雜質(zhì)；c.于16℃，50000Xg條件下超離心120min后，棄掉上清，再將離心管倒置晾干；d.將上述沉淀溶于1XPBS中，離心1000pm，1～2min除去不溶物，所獲的上清即為濃縮后的表達(dá)CD19和CD20抗體基因嵌合抗原受體的慢病毒載體。本專利技術(shù)的有益效果在于：本專利技術(shù)表達(dá)CD19和CD20抗體基因嵌合抗原受體的慢病毒載體的制備方法具有簡(jiǎn)單易行，耗時(shí)短，重復(fù)性高，所生產(chǎn)的慢病毒具有很高的感染效率，可高效表達(dá)目的基因，且很少引發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，應(yīng)用范圍十分廣泛。附圖說明：圖1是本專利技術(shù)表達(dá)CD19和CD20抗體基因嵌合抗原受體的慢病毒載體的制備流程圖；圖2是實(shí)施例的制備方法中10層的CellStack培養(yǎng)盤示意圖。具體實(shí)施方式：下面對(duì)本專利技術(shù)的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此，凡是對(duì)本專利技術(shù)技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本專利技術(shù)技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋在本專利技術(shù)的保護(hù)范圍中。一種表達(dá)CD19和CD20抗體基因嵌合抗原受體的慢病毒載體的制備方法，包括以下步驟：S1：293T細(xì)胞的準(zhǔn)備a.從初始細(xì)胞庫(kù)復(fù)蘇293T細(xì)胞；b.將復(fù)蘇的293T細(xì)胞懸浮于10％FBSDMEM培養(yǎng)基中(含4.5g/L葡糖糖，1本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種表達(dá)CD19和CD20抗體基因嵌合抗原受體的慢病毒載體，其特征在于：所述慢病毒載體是通過將含有CD19和CD20抗體基因嵌合抗原受體基因的穿梭表達(dá)載體與輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，重組收獲及濃縮即形成表達(dá)CD19和CD20抗體基因嵌合抗原受體的慢病毒載體。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種表達(dá)CD19和CD20抗體基因嵌合抗原受體的慢病毒載體，其特征在于：所述慢病毒載體是通過將含有CD19和CD20抗體基因嵌合抗原受體基因的穿梭表達(dá)載體與輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，重組收獲及濃縮即形成表達(dá)CD19和CD20抗體基因嵌合抗原受體的慢病毒載體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)CD19和CD20抗體基因嵌合抗原受體的慢病毒載體的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：S1：293T細(xì)胞的準(zhǔn)備a.從初始細(xì)胞庫(kù)中復(fù)蘇293T細(xì)胞；b.將復(fù)蘇的293T細(xì)胞懸浮于10％FBSDMEM培養(yǎng)基中，接種于T75培養(yǎng)瓶中置于37℃條件下，5％CO2孵育箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)；c.將培養(yǎng)的293T細(xì)胞每隔3～4天進(jìn)行傳代擴(kuò)增培養(yǎng)一次；S2：慢病毒CD19和CD20表達(dá)質(zhì)粒與輔助包裝質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染a.將所述傳代擴(kuò)增的293T細(xì)胞于CellStack培養(yǎng)盤中，2天后當(dāng)細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)盤面積的80％時(shí)開始轉(zhuǎn)染；b.準(zhǔn)備共轉(zhuǎn)染混合物，根據(jù)CellStack培養(yǎng)盤的用量或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞量的比例進(jìn)行擴(kuò)大或縮減轉(zhuǎn)染，備用；c.按照順序依次加入含有CD19和CD20基因的慢病毒載體和輔助包裝質(zhì)粒，并將所述輔助包裝質(zhì)粒溶于pH7.9的TE緩沖液中；d.再加入CaCl2和pH7.2的2XHEPES生理緩沖液混勻后，置于室溫下5min～30min；e.移去培養(yǎng)盤中原有的培養(yǎng)基，加入所述備用的共轉(zhuǎn)染混合物和含有2％FBS的DMEM培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)盤置于37℃，5％CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)2～3h；f.移除共轉(zhuǎn)染混合物后，加入含有丁酸鹽的2％FBS的DMEM培養(yǎng)基中，再將培養(yǎng)盤置于37℃，5％CO2孵育箱進(jìn)行培養(yǎng)72h；S3：重組慢病毒收獲及濃縮a.收獲上述培養(yǎng)72h后的重組慢病毒上清，即得粗制慢病毒；b.將收獲的粗制慢病毒上清經(jīng)過濾器過濾，以清除細(xì)胞雜質(zhì)；c.于16℃，50000Xg條件下超離心120min后，棄掉上清，再將離心管倒置晾干；d.將上述沉淀溶于1XPBS中，離心1000pm，1～2min除去不溶物，所獲的上清即為濃縮后的表達(dá)CD19和CD20抗體基因嵌合抗原受體的慢病毒...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：朱分祿，劉曉明，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：劉曉明，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：寧夏,64