灌注培養方法及其用途技術

本發明專利技術提供培養哺乳動物細胞的方法和利用這些培養方法的多種方法。還提供多孔細胞培養板用于例如灌注培養方法中。

Perfusion culture method and use thereof

The present invention provides methods for culturing mammalian cells and a variety of methods for utilizing these cultures. A porous cell culture plate is also provided for example in a perfusion culture method.

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】灌注培養方法及其用途相關申請的交叉引用本申請要求保護2014年6月6日提交的美國臨時專利申請系列號62/009,058的優先權，其全部內容在本文通過提述并入。
本專利技術涉及分子生物學方法、細胞培養工藝開發方法和重組蛋白的制造方法。背景含有編碼重組蛋白的核酸的哺乳動物細胞經常用于生產治療上或商業上重要的蛋白質。雖然數種高通量(highthroughput，HT)的細胞培養系統已在生物技術工業中用于補料分批方法數年，但是沒有已知存在的使用多孔板用于基于灌注的細胞培養的HT模型。概述本專利技術(至少部分上)基于如下發現：在多孔板中以本文描述的具體方式培養哺乳動物細胞導致實質性改進的活細胞密度和重組蛋白產生，并提供了大規模灌注、生產生物反應器中培養表現的精確模型。鑒于這一發現，本文提供培養哺乳動物細胞的方法、產生重組蛋白的方法和用于測試制備重組蛋白的制造工藝的方法。還提供多孔細胞培養板系統，其能夠用于例如實施任何本文所述的方法。本專利技術提供培養哺乳動物細胞的方法，其包括：提供多孔板，所述多孔板包含至少一個含有置于第一液體培養基中的哺乳動物細胞的孔，其中所述第一液體培養基占據約5％至約70％的孔體積；在約31℃至約40℃并伴隨約320轉每分鐘(RPM)至約500RPM旋轉攪拌將所述多孔板溫育一段時間；和在該段時間過程中，連續地或周期性地去除第一體積的第一液體培養基并向所述第一液體培養基添加第二體積的第二液體培養基，其中所述第一和第二體積大致相等。在這些方法的一些實施方案中，所述哺乳動物細胞是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。在這些方法的一些實施方案中，所述CHO細胞含有編碼重組蛋白(例如，免疫球蛋白、酶、生長因子、蛋白片段或工程化蛋白)的核酸。還提供產生重組蛋白的方法，其包括：提供多孔板，所述板包含至少一個包含置于第一液體培養基中的一哺乳動物細胞的孔，其中所述第一液體培養基占據約5％至約70％的孔體積，并且所述哺乳動物細胞含有編碼重組蛋白的核酸；在約31℃至約40℃并伴隨約320轉每分鐘(RPM)至約500RPM旋轉攪拌將所述多孔板溫育一段時間；在該段時間過程中，連續地或周期性地去除第一體積的第一液體培養基并向所述第一液體培養基添加第二體積的第二液體培養基，其中所述第一和第二體積大致相等；和從所述哺乳動物細胞或從所述第一或第二培養基回收所述重組蛋白。在這些方法的一些實施方案中，所述重組蛋白(例如，免疫球蛋白、酶、生長因子、蛋白片段或工程化蛋白)回收自所述哺乳動物細胞。在這些方法的一些實施方案中，所述重組蛋白(例如，分泌的免疫球蛋白、分泌的酶、分泌的生長因子、分泌的蛋白片段或分泌的工程化蛋白)回收自所述第一或第二液體培養基。還提供用于測試用于制備重組蛋白的制造工藝的方法，其包括：提供一多孔板，其包含至少一個包含置于第一液體培養基中的哺乳動物細胞的孔，其中所述第一液體培養基占據約5％至約70％的孔體積，并且所述哺乳動物細胞含有編碼重組蛋白的核酸；在約31℃至約40℃并伴隨約320轉每分鐘(RPM)至約500RPM旋轉攪拌將所述多孔板溫育一段時間；在該段時間過程中，連續地或周期性地去除第一體積的第一液體培養基并向所述第一液體培養基添加第二體積的第二液體培養基，其中所述第一和第二體積大致相等；檢測所述哺乳動物細胞中或所述第一或第二液體培養基中的所述重組蛋白；和將所述哺乳動物細胞中或所述第一或第二液體培養基中存在的重組蛋白的量與重組蛋白的參考水平進行比較。在這些方法的一些實施方案中，所述重組蛋白的參考水平是使用不同的培養方法產生的重組蛋白的水平。在這些方法的一些實施方案中，所述不同培養的方法利用不同的第一或第二液體培養基、不同的哺乳動物細胞、不同的溫度、不同的攪拌水平或不同的多孔板。在這些方法的一些實施方案中，所述不同的培養方法利用不同的原材料、抗結塊劑或化學上限定的液體培養基。在一些實施方案中，這些方法用于例如進行高通量細胞培養實驗來執行實驗設計(design-of-experiment；DOE)或質量源于設計(quality-by-design；QDB)研究。在這些方法的一些實施方案中，在所述第一或第二液體培養基中檢測所述重組蛋白(例如，分泌的免疫球蛋白、分泌的酶、分泌的生長因子、分泌的蛋白片段或分泌的工程化蛋白)。在這些方法的一些實施方案中，在所述細胞中檢測所述重組蛋白(例如，免疫球蛋白、酶、生長因子、蛋白片段或工程化蛋白)。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述第一體積的第一液體培養基基本上不含哺乳動物細胞。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述第一液體培養基占據約10％至約60％的孔體積。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述哺乳動物細胞是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述旋轉攪拌為約320RPM至約400RPM。在本文描述的任何方法中，去除第一體積的第一液體培養基和添加第二體積的第二液體培養基同時進行。在本文描述的任何方法中，去除第一體積的第一液體培養基和添加第二體積的第二液體培養基連續或周期性進行。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，去除的第一液體培養基的第一體積和添加的第二培養基的第二體積隨時間增加。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，將所述多孔板溫育超過7天的一段時間，并且在溫育的第1至3天中的每24小時的時間段內，去除的第一液體培養基的第一體積和添加的第二培養基的第二體積是第一液體培養基的體積的約30％至約50％；在培養的第4至6天中的每24小時的時間段內，去除的第一液體培養基的第一體積和添加的第二培養基的第二體積是第一液體培養基的體積的約40％至約70％；并且從培養的第7天起的每24小時的時間段內，去除的第一液體培養基的第一體積和添加的第二培養基的第二體積是第一液體培養基的體積的約90％至約150％。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述孔具有約1mL至約18mL的體積(例如，約1mL至約7mL或約1mL至約3.5mL)。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述多孔板是6孔板、12孔板、24孔板、48孔板或96孔板。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述多孔板是深孔板(deep-wellplate)。在本文描述的任何方法的一些實施方案中所述孔的底部直徑為約6.0mm至約35mm(例如，約12mm至約50mm)。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述孔的高度為約12mm至約50mm。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述哺乳動物細胞懸浮在約150μL至約15mL(例如，約150μL至約10mL，約150μL至約5mL或約150μL至約150μL)的第一培養基中。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述第一液體培養基和/或第二液體培養基選自下組：化學上限定的液體培養基、無血清液體培養基、含血清液體培養基、無動物來源組分的液體培養基和無蛋白質培養基。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，在約最初的24至48小時的時間段之后，在每24小時的時間段內，去除的第一液體培養基的第一體積和添加的第二培養基的第二體積是第一液體培養基的體積的約30％至約150％。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，在去除所述第一體積的第一液體培養基之前，本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種培養哺乳動物細胞的方法，所述方法包括：提供包含至少一個孔的多孔板，所述孔包含置于第一液體培養基中的哺乳動物細胞，其中所述第一液體培養基占據約5％至約70％的孔體積；在約31℃至約40℃并以約320轉每分鐘(RPM)至約500RPM旋轉攪拌，將所述多孔板溫育一段時間；和在所述時間段過程中，連續地或周期性地去除第一體積的第一液體培養基，并向所述第一液體培養基添加第二體積的第二液體培養基，其中所述第一和第二體積大致相等。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2014.06.06 US 62/009,0581.一種培養哺乳動物細胞的方法，所述方法包括：提供包含至少一個孔的多孔板，所述孔包含置于第一液體培養基中的哺乳動物細胞，其中所述第一液體培養基占據約5％至約70％的孔體積；在約31℃至約40℃并以約320轉每分鐘(RPM)至約500RPM旋轉攪拌，將所述多孔板溫育一段時間；和在所述時間段過程中，連續地或周期性地去除第一體積的第一液體培養基，并向所述第一液體培養基添加第二體積的第二液體培養基，其中所述第一和第二體積大致相等。2.權利要求1的方法，其中所述哺乳動物細胞是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。3.權利要求2的方法，其中所述CHO細胞含有編碼重組蛋白的核酸。4.權利要求3的方法，其中所述重組蛋白是免疫球蛋白、酶、生長因子、蛋白片段或工程化蛋白。5.一種產生重組蛋白的方法，該方法包括：提供包含至少一個孔的多孔板，所述孔包含置于第一液體培養基中的哺乳動物細胞，其中所述第一液體培養基占據約5％至約70％的孔體積，并且所述哺乳動物細胞含有編碼重組蛋白的核酸；在約31℃至約40℃并以約320轉每分鐘(RPM)至約500RPM旋轉攪拌，將所述多孔板溫育一段時間；在所述時間段過程中，連續地或周期性地去除第一體積的第一液體培養基并向所述第一液體培養基添加第二體積的第二液體培養基，其中所述第一和第二體積大致相等；和從所述哺乳動物細胞或從所述第一或第二培養基回收所述重組蛋白。6.權利要求5的方法，其中所述重組蛋白回收自所述哺乳動物細胞。7.權利要求6的方法，其中所述重組蛋白是免疫球蛋白、酶、生長因子、蛋白片段或工程化蛋白。8.權利要求5的方法，其中所述重組蛋白回收自所述第一或第二液體培養基。9.權利要求8的方法，其中所述重組蛋白是分泌的免疫球蛋白、分泌的酶、分泌的生長因子、分泌的蛋白片段或分泌的工程化蛋白。10.一種用于測試用于制備重組蛋白的制造工藝的方法，所述方法包括：提供包含至少一個孔的多孔板，所述孔包含置于第一液體培養基中的哺乳動物細胞，其中所述第一液體培養基占據約5％至約70％的孔體積，并且所述哺乳動物細胞含有編碼重組蛋白的核酸；在約31℃至約40℃并伴隨約320轉每分鐘(RPM)至約500RPM旋轉攪拌，將所述多孔板溫育一段時間；在所述時間段過程中，連續地或周期性地去除第一體積的第一液體培養基并向所述第一液體培養基添加第二體積的第二液體培養基，其中所述第一和第二體積大致相等；檢測所述哺乳動物細胞中或所述第一或第二液體培養基中的重組蛋白；和將所述哺乳動物細胞中或所述第一或第二液體培養基中存在的重組蛋白的量與重組蛋白的參考水平進行比較。11.權利要求10的方法，其中所述重組蛋白的參考水平是使用不同的培養方法產生的重組蛋白的水平。12.權利要求11的方法，其中所述不同的培養方法利用不同的第一或第二液體培養基、不同的哺乳動物細胞、不同的溫度、不同的攪拌水平或不同的多孔板。13.權利要求11的方法，其中所述不同的培養方法利用不同的原材料、抗結塊劑或化學上限定的液體培養基。14.權利要求10的方法，其中所述方法用于實施高通量細胞培養實驗來執行實驗設計(design-of-experiment；DOE)或質量源于設計(quality-by-design；QBD)研究。15.權利要求10的方法，其中在所述第一或第二液體培養基中檢測所述重組蛋白。16.權利要求15的方法，其中所述重組蛋白是分泌的免疫球蛋白、分泌的酶、分泌的生長因子、分泌的蛋白片段或分泌的工程化蛋白。17.權利要求10的方法，其中在所述細胞中檢測所述重組蛋白。18.權利要求17的方法，其中所述重組蛋白是免疫球蛋白、酶、生長因子、蛋白片段或工程化蛋白。19.權利要求1、5和10中任一項的方法，其中所述第一體積的第一液體培養基基本上不含哺乳動物細胞。20.權利要求1、5和10中任一項的方法，其中所述第一液體培養基占據約10％至約60％的孔體積。21.權利要求5或10的方法，其中所述哺乳動物細胞是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。22.權利要求1、5和10中任一項的方法，其中所述旋轉攪拌為約320RPM至約400RPM。23.權利要求1、5和10中任一項的方法，其中去除第一體積的第一液體培養基和添加第二體積的第二液體培養基同時實施。24.權利要求1、5和10中任一項的方法，其中去除第一體積的第一液體培養基和添加第二體積的第二液體培養基連續實施。25.權利要求1、5和10中任一項的方法，其中去除第一體積的第一液體培養基和添加第二體積的第二液體培養基周期性實施。26.權利要求1、5和10中任一項的方法，其中去除的第一液體培養基的第一體積和添加的第二培養基的第二體積隨時間增加。27.權利要求1、5和10中任一項的方法，其中：將所述多孔板溫育超過7天的時間段，并且在溫育的第1至3天中的每24小時時段內，去除的第一液體培養基的第一體積和添加的第二培養基的第二體積是第一液體培養基的體積的約30％至約50％；在培養的第4至6天中的每24小時的時間段內，去除的第一液體培養基的第一體積和添加的第二培養基的第二體積是第一液體培養基的體積的約40％至約70％；并且從培養的第7天起的每24小時的時間段內，去除的第一液體培養基的第一體積和添加的第二培養基的第二體積是第一液體培養基的體積的約90％至約150％。28.權利要求1、5和10中任一項的方法，其中所述孔具有約1mL至約18mL的體積。29.權利要求1、5和10中任一項的方法，其中所述孔具有約1mL至約7mL的體積。30.權利要求1、5和10中任一項的方法，其中所述孔具有約1mL至約3.5mL的體積。31.權利要求1、5和10中任一項的方法，其中所述多孔板是6孔板、12孔板、24孔板、48孔板或96孔板。32.權利要求1、5和10中任一項的方法，其中所述多孔板是深孔板。33.權利要求1、5和10中任一項的方法，其中所述孔的底部直徑為約6.0mm至約35mm。34.權利要求1、5和10中任一項的方法，其中所述孔的高度為約12mm至約50mm。35.權利要求1、5和10中任一項的方法，其中所述哺乳動物細胞懸浮在約150μL至約15mL的第一培養基中。36.權利要求35的方法，其中...

【專利技術屬性】
技術研發人員：A·維利格奧伯貝克，J·楊，Y·楊，G·羅恩佐，
申請(專利權)人：建新公司，
類型：發明
國別省市：美國,US