培養基及其用途制造技術

本發明專利技術公開了用于體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞的一組培養基和試劑盒，及其在體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞中的用途、體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞的方法，以及內皮細胞或其衍生物。其中，該組培養基包括：第一培養基，其為添加了胰島素鐵硒傳遞蛋白、BSA、非必需氨基酸和rhBMP-4的IMDM/F12培養基；第二培養基，其為添加了胰島素鐵硒傳遞蛋白、BSA、非必需氨基酸、rhVEGF和rhbFGF的IMDM/F12培養基；以及第三培養基，其為EGM2培養基。利用本發明專利技術的該組培養基能夠高效快速地誘導胚胎干細胞向內皮祖細胞及內皮細胞進行分化。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及內皮細胞再生
，具體地涉及培養基及其用途。更具體地，本專利技術涉及用于體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞的一組培養基和試劑盒，及其在體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞中的用途、體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞的方法，以及內皮細胞或其衍生物。
技術介紹
心血管系統是胚胎發育中首先出現并發揮功能的系統。血管的發生和發育不僅對于胚胎形成中器官的發育和分化十分重要，對于成體的創傷修復和生殖功能也是具有重要意義的。血管發育在一系列病理現象中也有重要作用，如視網膜增殖、衰老相關的退行性斑點、類風濕性關節炎以及迄今仍無有效治療手段的腫瘤發生等。血管內皮細胞裱襯在整個心血管系統的內表面，為單層扁平上皮，是血管壁與血液之間的分界細胞，是形成心血管封閉管道系統的形態基礎。其在組織的動態平衡、纖維蛋白溶解和凝集、血液-組織分子交換、血管收縮調控、正常和腫瘤組織的血管化、以及生理和病理條件下的血細胞的活化和遷移中都發揮了重要作用。目前人們多認為血管內皮細胞除作為血液和組織間物質轉運的屏障外，最主要的生物學功能是使循環血液保持流動狀態，此外血管內皮細胞尚可合成與分泌多種結締組織成分、參與一些物質的代謝及與白細胞相互作用等。上述這些生理過程的發揮都依賴于對血管內皮細胞精密的調控，而失調則導致病理現象的發生。研究決定內皮細胞分化和表型的分子機制對于闡明血管發生發育的原理、對梗 死或損傷組織的血管新生治療以及抗腫瘤治療都有重要的指導意義。人類胚胎干細胞(human embryonic stem cells, hESCs)作為一種具備自我更新和無限增殖潛能的多能性細胞，其向內皮細胞分化的可能性為心血管疾病和四肢缺血的治療提供了令人興奮的前景。近年來，不斷有研究證實，人胚胎干細胞hESCs具有分化成不同發育階段的內皮細胞的能力。通過與小鼠的基質細胞共培養、誘導形成擬胚體(EBs)并添加促血管發育的因子、或與特殊的二維介質的共培養等策略營造內皮發育微環境，已有多個研究小組從hESCs中分化、分離到了內皮細胞。近期的研究結果顯示hESCs來源的內皮細胞能形成新的血管，提高梗死心臟的功能，是細胞替代治療中新的細胞源。雖然取得了這些成果，但是使用EBs (擬胚體)添加內皮相關誘導因子，與基質細胞共培養或者是使用基質膠添加因子來誘導分化產生內皮細胞，一般都會再通過分選的方式獲得相對較純的內皮細胞，之后再擴大培養。但是由于本身使用這些誘導方法產生的內皮細胞的比例及數量就較少，再加之分選之后在體外擴增的倍數有限，也難以用于臨床治療。高效快速的誘導胚胎干細胞向內皮祖細胞及內皮細胞進行分化依然是難以解決的問題。
技術實現思路
本專利技術旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本專利技術的一個目的在于提出一種能夠用于體外誘導胚胎干細胞(ESCs)分化為內皮細胞的培養基、試劑盒及方法。根據本專利技術的一個方面，本專利技術提供了一組培養基。根據本專利技術的實施例，該組培養基包括:第一培養基，該第一培養基為添加了胰島素鐵硒傳遞蛋白、BSA、非必需氨基酸和rhBMP-4的IMDM/F12培養基；第二培養基，該第二培養基為添加了胰島素鐵硒傳遞蛋白、BSA、非必需氨基酸、rhVEGF和rhbFGF的MDM/F12培養基；以及第三培養基，該第三培養基為EGM2培養基。專利技術人驚奇地發現，利用本專利技術的上述培養基能夠高效快速地誘導ESCs向內皮祖細胞及內皮細胞進行分化，從而能夠有效地制備獲得大量的內皮細胞，進而能夠有效地為ECs (即內皮細胞)應用于心血管疾病和四肢缺血的治療提供了細胞基礎。另外，根據本專利技術上述實施例的一組培養基還可以具有如下附加的技術特征:根據本專利技術的一個實施例，該MDM/F12培養基包含:75%的添加了 GlutaMAX -1的IMDM培養基；以及25%的添加了 GlutaMAX -1的F12培養基。其中，在本文中所述的“GlutaMAX -1”表示谷丙氨酸二肽。根據本專利技術的一個實施例，該第一培養基中包含1%的胰島素鐵硒傳遞蛋白(Insulin-Transferrin-Selenium, ITS)、0.05%BSA (即牛血清白蛋白)、1% 非必需氨基酸(其英文縮寫為“NEAA”)和25ng/ml rhBMP-4 (即重組人骨形態發生蛋白4)。由此，利用該不含血清、成分明確且含有誘導分化因子rhBMP-4的第一培養基，在rhBMP-4合適的濃度及作用時間下能夠高效誘導ESCs向中內胚層進行分化，這是由ESCs來源獲得內皮細胞的基礎。根據本專利技術的一個實施例，該第二培養基中包含1%胰島素鐵硒傳遞蛋白、0.05%BSA、1%NEAA (非必需氨基酸)、50ng/ml rhVEGF (即重組人血管內皮細胞生長因子)以及50ng/ml rhbFGF (即堿性成纖維細胞生長因子)。由此，利用該不含血清、成分明確且含有對于內皮誘導分化及擴大培養有明顯促進作用的rhVEGF和rhbFGF生長因子的第二培養基，能夠有效地誘導ESCs來源的中內胚層細胞向內皮祖/內皮細胞分化。根據本專利技術的一 個實施例，進一步包括:第四培養基，該第四培養基為添加了Knockout血清替代物、L-谷氨酰胺、P -巰基乙醇、非必需氨基酸和rhbFGF的D-MEM/F-12培養基；以及第五培養基，該第五培養基為mTeSR培養基。根據本專利技術的一個實施例，第四培養基中包含20%KnoCkout血清替代物、ImML-谷氨酰胺、0.1mMP-巰基乙醇、1%非必需氨基酸和5ng/ml bFGF。根據本專利技術的一些實施例，該成分明確，營養豐富，含有能夠維持ESCs (胚胎干細胞)干性的rhbFGF生長因子的第四培養基，能夠與滋養層細胞共同長期培養ESCs并能夠有效維持ESCs的特性。根據本專利技術的又一方面，本專利技術還提供了一種用于體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞的試劑盒。根據本專利技術的實施例，該試劑盒包含前面所述的本專利技術的一組培養基。根據本專利技術的一些實施例，利用本專利技術的試劑盒，采用其中的培養基培養胚胎干細胞，能夠高效地實現體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞，從而能夠有效地制備獲得大量的內皮細胞，對于心血管疾病和四肢缺血的治療意義重大。根據本專利技術的另一方面，本專利技術還提供了前面所述的一組培養基，或者試劑盒在體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞中的用途。從而，利用上述一組培養基或試劑盒，能夠有效地實現體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞，且誘導分化的效率尤其高。根據本專利技術的再一方面，本專利技術還提供了一種體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞的方法。根據本專利技術的實施例，該方法包括以下步驟:利用前面所述的一組培養基，培養胚胎干細胞。由此，能夠高效快速地誘導ESCs向內皮祖細胞及內皮細胞進行分化，從而能夠有效地制備獲得大量的內皮細胞，其對心血管疾病和四肢缺血的治療意義重大。根據本專利技術的一個實施例，在本專利技術的體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞的方法中，胚胎干細胞來源于人類。根據本專利技術的一個實施例，在本專利技術的體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞的方法中，利用前面所述的一組培養基，培養胚胎干細胞進一步包括:利用該第一培養基對該胚胎干細胞進行第一誘導分化培養，以便獲得經過第一誘導分化培養的細胞；利用該第二培養基對該經過第一誘導分化培養的細胞進行第二誘導分化本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一組培養基，其特征在于，包括：第一培養基，所述第一培養基為添加了胰島素鐵硒傳遞蛋白、BSA、非必需氨基酸和rhBMP?4的IMDM/F12培養基；第二培養基，所述第二培養基為添加了胰島素鐵硒傳遞蛋白、BSA、非必需氨基酸、rhVEGF和rhbFGF的IMDM/F12培養基；以及第三培養基，所述第三培養基為EGM2培養基。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：裴雪濤，謝小燕，岳文，何麗娟，李艷華，南雪，姚海雷，房芳，張博文，
申請(專利權)人：中國人民解放軍軍事醫學科學院野戰輸血研究所，
類型：發明
國別省市：