一種誘導胚胎干細胞為胰腺組織樣細胞的方法，包括采用懸滴培養法使胚胎干細胞分化為三個胚層細胞，并使用免疫磁珠細胞分選法純化出定型內胚層細胞；利用定型內胚層細胞，進一步誘導使其分化為胰腺前體細胞；使胰腺前體細胞在體外進一步分化，形成較高淀粉酶分泌能力的胰腺組織樣細胞。本發明專利技術的技術方案采用多種誘導因子分階段誘導分化方式，表明了胚胎干細胞具有分化為胰腺外分泌細胞的潛能，并找出了誘導胚胎干細胞為胰腺組織樣細胞的有效途徑，使胰腺前體細胞修復胰腺損傷成為可能，為胰腺損傷提供更多細胞來源。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種生物工程領域，具體涉及。
技術介紹
胰腺是人體重要的內、外分泌器官，位于腹上區和左季肋區的腹膜后面，分為內分泌部和外分泌部兩部分。外分泌部由導管(導管細胞的標志分子CK19)和腺泡構成，可合成并分泌淀粉酶(amylase)、脂肪酶等。內分泌部分散在外分泌部之間，主要由A細胞、B細胞、D細胞和PP細胞組成，分別分泌胰高血糖素、胰島素、生長抑素和胰多肽。目前急性重癥胰腺炎、慢性胰腺炎和胰腺癌的治療十分棘手。而研究胰腺外分泌細胞在體外的分化及發育過程，可能為研究胰腺疾病的發生機制提供新思路，為研究胰腺損傷提供新的治療方法。干細胞具有強大的自我更新及多向分化潛能，為多種疾病的治療提供了一種新的手段。干細胞根據發育階段不同分為胚胎干細胞和成體干細胞。胚胎干細胞(embryonicstem cell，ESC)是指著床前的囊胚內細胞團或早期胚胎的原始生殖細胞。ESC具有增殖、自我更新和強大的多向分化能力，在體內、外可以誘導分化為幾乎所有的組織細胞。1981年Evans等分離小鼠胚胎干細胞，建立小鼠的胚胎干細胞系。研究表明小鼠ESC在去除LIF的培養基中可以形成胚體(embryonic bodies, EBs),分化為外、中、內胚層，內胚層包括定型內胚層和臟內胚層。定型內胚層起源于前原腸胚，隨著胚胎的發育形成原始消化道及與消化道相關的臟器組織，比如胰腺、肝臟等。因此定型內胚層可以作為胰腺細胞、肝細胞及腸道上皮細胞的前體細胞群，進行體外定向誘導分化的研究。近年來，研究胚胎干細胞在體外誘導分化為胰島素分泌細胞及胰島樣細胞較多，研究分化為胰腺外分泌細胞的報道甚少。在Gouon-Evans V等人的研究中，以ESC來源的定型內胚層為前體細胞，通過BMP-4的誘導，成功在體外獲得 可以產生甲胎蛋白(AFP)及白蛋白的肝臟樣細胞，這一研究成果為以定型內胚層作為誘導分化的前體階段，實施胰腺前體細胞及胰腺內外分泌細胞的定向誘導分化提供了實驗基礎。信號通路在干細胞增殖分化中扮演了重要的調控角色。多個研究報道顯示，在ESC體外形成EB的自然分化過程中可以形成一定比例的定型內胚層。研究表明，在胚胎發育過程中，激活Nodal通路及抑制Shh通路可以誘導及促進胰腺細胞、組織的分化和發育。因此調控Nodal通路和Shh通路，為ESC體外誘導分化定型內胚層細胞，進一步誘導分化為胰腺組織樣細胞提供了有效途徑 '為ESC體外誘導分化為胰腺組織樣細胞修復胰腺損傷提供實驗基礎。
技術實現思路
本專利技術的所解決的技術問題在于提供，通過誘導胚胎干細胞分化為內胚層細胞，然后通過進一步誘導使其分化為胰腺前體細胞，隨后進一步分化為可以分泌淀粉酶的胰腺組織樣細胞。為此，本專利技術提供，包括如下步驟:步驟一、采用懸滴培養法使胚胎干細胞分化為三個胚層細胞，并使用免疫磁珠細胞分選法(Magnetic active cell sorting, MACS),純化出定型內胚層細胞;步驟二、利用定型內胚層細胞，進一步誘導使其分化為胰腺前體細胞；步驟三、使胰腺前體細胞在體外進一步分化，形成較高淀粉酶分泌能力的胰腺組織樣細胞。其中，所述步驟一是采用懸滴培養法使小鼠胚胎干細胞分化為三個胚層細胞，并使用定型內胚層的特異性標志物標記的磁珠分選純化出定型內胚層細胞；步驟三中胰腺組織樣細胞為胰腺外分泌細胞。步驟二、利用定型內胚層細胞，進一步使其分化胰腺前體細胞； 步驟三、使胰腺前體細胞，在體外進一步分化，形成較高淀粉酶分泌能力的胰腺外分泌細胞。優選地，所述小鼠胚胎干細胞為E14TG2a系小鼠胚胎干細胞。優選地，所述定型內胚層的特異性標志物為CXCR-4-分子。優選地,所述步驟二中是通過使用環杷明(Cyclopamine)及Exendin-4聯合誘導，使定型內胚層細胞分化為胰腺前體細胞。優選地,所述步驟二中環杷明和Exendin-4在培養基的濃度為1.0uM和ΙΟηΜ。優選地，所述步驟一的懸滴培養過程中包括:`使小鼠胚胎干細胞在去除白血病抑制因子的培養基中可以形成胚體；而后在無血清培養基中培養分化成三個胚層細胞，所述無血清培養基中添加有對定型內胚層分化起促進作用的誘導劑Activin A。優選地，所述步驟一中，使用定型內胚層的特異性標志物標記的磁珠分選純化出定型內胚層細胞包括如下步驟:取經Activin A誘導的胚體細胞，經消化處理后加入藻紅蛋白標記的大鼠抗小鼠CXCR-4單克隆抗體標記； 制成重懸細胞液后加入抗藻紅蛋白免疫磁珠搖勻、孵育苗，再分選純化出定型內胚層細胞。本專利技術的方法選擇免疫磁珠分選細胞，保證后續實驗的細胞活性，使細胞在分選后仍可保持較好增殖和好的狀態。在步驟一中，在無血清培養基中添加有對定型內胚層分化起促進作用的誘導劑Activin A懸滴培養的EB，定型內胚層細胞比例明顯增加，并使EB中CXCR4+細胞比例顯著高于對照組。從而說明Activin A誘導的EB，能夠分化得到更多的定型內胚層細胞。并以定型內胚層特異性標志CXCR-4作為分選標記，免疫磁珠分選出CXCR-4陽性細胞和CXCR-4陰性細胞，結合本專利技術實施中結論說明免疫磁珠分選可降低分化體系中胚胎干細胞的比例。因此，利用MACS可得到較高純度的分化細胞，且細胞存活率不受影響，為下一步誘導胰腺組織樣細胞提供更多的細胞來源。另外,在步驟二中通過使用環杷明(Cyclopamine)及Exendin-4聯合誘導,使定型內胚層細胞分化為胰腺前體細胞。本專利技術實施例中MACS分選CXCR4陽性細胞及陰性細胞分別添加和不添加l.0uM Cyclopamine和IOnM Exendin-4誘導分化實驗結果表明:CXCR4陰性細胞添加Cyclopamine和Exendin-4組，Shh表達量顯著低于不添加Cyclopamine和Exendin-4組，(所有P < 0.05)，Pdxl表達量在兩組間無差異(P>0.05) ；CXCR4陽性細胞在第1、5、7、9天添加與不添加Cyclopamine和Exendin-4組,Shh和Pdxl表達量差異性不顯著(P > 0.05) ；CXCR4陽性細胞在第3天加Cyclopamine和Exendin-4組，Shh表達量顯著低于無添加組(P均< 0.05)，而Pdxl表達量顯著高于無添加組(P均< 0.05)。胰腺外分泌部由導管(導管細胞的標志分子CK19)和腺泡構成，可合成并分泌淀粉酶、脂肪酶等，因此CK19和淀粉酶可作為評價及鑒定胰腺外分泌細胞的依據。在CXCR4+定型內胚層細胞添加Cyclopamine和Exendin-4誘導3天所得PdxlhlghShh1t5w胰腺前體細胞，該細胞繼續在體外分化后第3、6、9、12天的CK19和淀粉酶mRNA表達量均顯著高于同時間點CXCR4+定型內胚層細胞未添加(Cyclopamine和Exendin-4)誘導組及CXCR-4陰性細胞組(所有P < 0.05);結果證明，經Cyclopamine和Exendin-4誘導后的CXCR4陽性細胞具備更高的分化為胰腺外分泌細胞，即胰腺組織樣細胞的能力。總而言之，本專利技術的誘導胚胎干細胞為胰腺組織樣細胞的方法采用多種誘導因子分階段誘導分化方式，表明了胚胎干細胞具有分本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種誘導胚胎干細胞為胰腺組織樣細胞的方法，包括如下步驟：步驟一、采用懸滴培養法使胚胎干細胞分化為三個胚層細胞，并使用免疫磁珠細胞分選法，純化出定型內胚層細胞；步驟二、利用定型內胚層細胞，進一步誘導使其分化為胰腺前體細胞；步驟三、使胰腺前體細胞在體外進一步分化，形成較高淀粉酶分泌能力的胰腺組織樣細胞。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：于濤，陳其奎，
申請(專利權)人：于濤，陳其奎，
類型：發明
國別省市：
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