人類乳頭瘤病毒構建體制造技術

本發明專利技術實施方式提供用于重組生成蛋白或多肽的無標簽構建體的組合物和方法。在某些實施方式中，本文中揭示的重組蛋白或多肽涉及人類乳頭瘤病毒(HPV)。其它實施方式涉及在組合物中使用這些構建體來誘發受試者對一種或多種HPV類型的免疫反應。還揭示了用來預防和治療病毒感染的治療性和預防性疫苗。提供了為本文中預期的構建體編碼的核酸和表達載體。在某些實施方式中，生成的HPV衣殼蛋白沒有融合標簽。另外，預期了HPV?L1的截短形式。

Human papillomavirus construct

Embodiments of the present invention provide compositions and methods for the construction of unlabeled constructs for the generation of proteins or polypeptides. In some embodiments, recombinant proteins or polypeptides disclosed herein relate to human papillomavirus (HPV). Other embodiments involve using these constructs in the composition to induce subjects to respond to one or more HPV types of immune responses. Therapeutic and prophylactic vaccines for the prevention and treatment of viral infections are also disclosed. Nucleic acids and expression vectors are provided for coding the desired constructs in this paper. In some embodiments, the resulting HPV capsid protein has no fusion tag. In addition, the truncated form of HPV expected L1.

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】人類乳頭瘤病毒構建體政府資助本專利技術是在美國國家衛生研究院頒布的授權號為CA098252的政府資助下完成的。政府享有本專利技術中的某些權力。優先權本PCT申請主張2014年6月19日提交的美國臨時申請No.62/014,495的優先權。為了各種目的該申請作為一個整體通過引用而并入本文中。專利
本專利技術的實施方式為預防、治療和/或診斷人類乳頭瘤病毒感染及與此相關的宮頸癌提供新型疫苗和診斷試劑。本文中一些實施方式涉及沒有標簽、跟蹤劑或融合元素的人類乳頭瘤病毒(HPV)構建體。這些制品能夠用于在受試者中誘發對目標HPV的免疫反應。在某些實施方式中，由本文中揭示的組合物和方法生成的HPV構建體是殼粒。
技術介紹
乳頭瘤病毒是能夠感染多種不同種類的動物(包括人類在內)的致病性病毒。乳頭瘤病毒感染的特征通常表現為誘發上皮和纖維上皮腫瘤，或者位于感染位點的疣。每個種類的脊椎動物都可以被一組物種特異性的乳頭瘤病毒感染。例如，迄今為止，已分離了超過100種不同的人類乳頭瘤病毒基因型。乳頭瘤病毒是高度物種特異性的感染性試劑。尚未確認犬和兔乳頭瘤病毒會在異源物種(如人類)體內誘發乳頭瘤。抗一種乳頭瘤病毒型感染的免疫力通常似乎不會賦予抗另一種類型的免疫力，即使這些類型的乳頭瘤病毒感染同源物種時。乳頭瘤病毒誘發生殖器疣，這是一種流行性人類性傳播疾病。HPV6型和11型通常多與良性的生殖器疣尖銳濕疣存在聯系。生殖器疣非常普遍，并且相比于臨床感染，亞臨床的或不明顯的HPV感染甚至更加普遍。盡管多數HPV誘發的病變是良性的，由某種乳頭瘤病毒類型(如HPV-16和HPV-18)誘發的病變可能經歷惡性進展，從而可能導致宮頸癌。涉及宮頸癌的HPV基因型中，HPV-16是最常見的，在大約50％的宮頸癌中都有發現。鑒于普遍由乳頭瘤病毒感染造成的重大的健康風險，特別是人類乳頭瘤病毒感染，許多團隊已經報告了重組乳頭瘤病毒抗原的進展及作為診斷試劑和預防性疫苗的用途。一般而言，這些研究集中在制造含有單獨的主要衣殼蛋白(L1)或與次要衣殼蛋白(L2)組合的預防性疫苗。目前臨床試驗的預防性疫苗是基于VLPs(病毒樣顆粒)。VLPs是72個五聚體或主要乳頭瘤病毒衣殼蛋白L1的殼粒的集合體。然而，這些類型的疫苗的生產比較昂貴，因為需要真核表達系統或復雜的純化，并且不如殼粒制品穩定。VLP疫苗不能提供針對其它乳頭瘤病毒血清型的交叉保護，因為中和免疫反應傾向于類型特異性占主導。專利技術概述本文中揭示的實施方式提供沒有親和性或其它標簽的人類乳頭瘤病毒(HPV)殼粒，病毒衣殼的亞單位的有效組合物和生產方法，其中該構建體是無標簽的。根據這些實施方式，可以采用本文中揭示的組合物和方法，從任何HPV物種生成該HPV殼粒。在其它實施方式中，本文中生成的HPV蛋白或多肽可以用于生成在所描述的免疫原性組合物中使用的殼粒。根據這些實施方式，本文中揭示的實施方式中的殼粒可以用于以成本效率高的、高效的和穩定的方式生產用于使受試者免疫的免疫原性組合物，從而降低HPV感染的發病或發展的風險或者治療患有HPV感染的受試者。一些實施方式涉及使用產生HPV-蛋白的構建體來生成相比于標準方法大量的蛋白，同時消除了移除標簽或融合分子的需要，使這一過程更加有效率。這些無標簽構建體可以用來形成在本文中揭示的免疫原性組合物中使用的殼粒。本文中考慮的某些免疫原性組合物可以是藥學上可以接受的組合物，這些組合物是用來生成疫苗的免疫原性組合物或用來使受試者對乳頭瘤感染免疫的其它組合物。這些組合物可以用來在受試者中誘發對人類乳頭瘤病毒的免疫反應以保護受試者免于HPV感染。描述了由本文中揭示的組合物產生的用來預防和/或治療病毒性感染(如乳頭瘤病毒感染、宮頸癌和與此相關的疣)的預防性疫苗。也揭示了組合物中使用的編碼乳頭瘤病毒構建體或多肽的核酸和表達載體。在一些實施方式中，用本文中揭示的方法生成的構建體可以用來在細菌表達系統中表達HPV多肽以快速和成本效率高地生成和純化大量HPV多肽。根據這些實施方式，用這些方法生產的HPV多肽可以被用于藥物組合物或其它組合物中。因為這些HPV多肽沒有被融合或者不包含標簽或其它跟蹤分子，所以不需要進一步處理。其它實施方式進一步提供了使用本文中描述的無標簽構建體生成的殼粒劑型。例如，完整結構的乳頭瘤病毒蛋白L1可以用來生成無標簽構建體。L1的序列是本領域熟知的并且可以在例如作為整體被并入本文中的U.S.Pat.No.6,228,368中找到。某些實施方式涉及HPVL1的截短形式。根據這些實施方式，本文中描述的HPVL1的截短形式可以包括具有位于N-端的至少3個且不超過24個氨基酸的截短和位于C-端的至多29個氨基酸的截短。根據這些實施方式，截短的L1蛋白可以形成五聚體殼粒亞單位并且可以包含HPV病毒粒子中發現的中和表位，但是缺乏形成如完整病毒衣殼或VLPs這樣高階結構的能力。附圖說明下面的附圖組成本說明書的一部分，并且用于進一步展示某些實施方式。通過單獨參考一個或更多這些附圖或者結合所提供的實施方式的詳細描述，一些實施方式可以被更好的理解。圖1說明了本文中揭示的某些實施方式中的示例性表達質粒的構建體。圖2示出了圖1所示的質粒構建體的瓊脂糖凝膠電泳分離圖像。圖3示出了證實在大腸桿菌中表達/誘導L1蛋白的典型SDS-PAGE的圖像。誘導時間在頂部的上圖中表示(以小時為單位)。L1的位置由箭頭指示。圖4示出了與V5構象抗體的ELISA反應性。圖5示出了確認特征五聚體的形成的電子顯微照片。圖6A-圖6D示出了來自HPV假病毒中和試驗的曲線圖。圖7示出了證實N-端缺失3、5或9個氨基酸的HPV16L1的表達的典型SDS-PAGE圖像。圖8示出了證實N-端缺失13或15個氨基酸的HPV16L1的表達的典型SDS-PAGE圖像。圖9示出了證實N-端缺失20或25個氨基酸的HPV16L1的表達的典型SDS-PAGE圖像。圖10示出了證實N-端缺失5或9個氨基酸的HPV18L1的表達的典型SDS-PAGE圖像。圖11示出了證實N-端缺失15或16個氨基酸的HPV18L1的表達的典型SDS-PAGE圖像。具體實施方式在下面的部分，為了詳細描述各種實施方式，描述了多種示例性組合物和方法。對本領域技術人員來說顯而易見的是，實踐各種實施方式不需要使用所有甚至部分的本文中所概述的細節，而是可以通過常規試驗修改濃度、時間和其它細節。在一些情況中，描述中沒有包括熟知的方法和組分。本文中揭示的組合物和方法涉及有效和低價地生產大量目標蛋白或多肽，其中未使用用于生產或分離的標簽或融合多肽生產目標。可以預料的是，這些方法對快速生產目標蛋白并且避免與使用標簽或其它跟蹤劑相關的非必要步驟是有效的。之前描述了可以從融合蛋白形式的構建體表達乳頭瘤病毒衣殼蛋白L1蛋白。這些融合蛋白在細菌生物中作為重組分子被表達時可以保持L1天然構象和免疫原性的活性，如由利用例如中和抗體的試驗測定的。為了跟蹤目標蛋白或多肽的合成和/或純化，當前本領域熟知的蛋白或多肽構建體需要用于表達的標簽，這就需要材料(如標簽或示蹤劑)和人力上的額外花費以從存儲和后續使用的制品的最終產品中去除該標簽。這些額外的要求減緩了生產過程，并且在某些情況中可以導致目標分子的制造本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種質粒構建體，包含：具有轉錄起始密碼子的目標人類乳頭瘤病毒(HPV)DNA分子，所述目標HPV?DNA分子編碼一種或多種蛋白或多肽；與所述目標HPV?DNA分子相連、能夠誘導所述目標HPV?DNA轉錄的啟動子；位于所述啟動子和所述目標HPV?DNA分子之間的限制位點；能夠賦予對抗篩選劑的抗性基因，并且所述質粒構建體沒有標簽或跟蹤分子，是無標簽的。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2014.06.19 US 62/014,4951.一種質粒構建體，包含：具有轉錄起始密碼子的目標人類乳頭瘤病毒(HPV)DNA分子，所述目標HPVDNA分子編碼一種或多種蛋白或多肽；與所述目標HPVDNA分子相連、能夠誘導所述目標HPVDNA轉錄的啟動子；位于所述啟動子和所述目標HPVDNA分子之間的限制位點；能夠賦予對抗篩選劑的抗性基因，并且所述質粒構建體沒有標簽或跟蹤分子，是無標簽的。2.根據權利要求1所述的質粒構建體，其中所述目標HPVDNA分子編碼單一蛋白或嵌合蛋白。3.根據權利要求1所述的質粒構建體，其中所述目標HPVDNA編碼在抗所述目標HPV的免疫原性組合物中使用的蛋白或多肽。4.根據權利要求1所述的質粒構建體，其中所編碼的蛋白或多肽選自HPV6、HPV6a、HPV6b、HPV11、HPV16、HPV18、HPV30、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV51、HPV52、HPV54、HPV55、HPV56和HPV70中的一種或多種。5.根據權利要求1所述的質粒構建體，其中所述目標HPVDNA分子編碼截短的HPVL1蛋白，所述截短的HPVL1蛋白具有下述中的至少一種：在N-端缺失3個且不超過24個氨基酸和在C-端缺失多達29個氨基酸。6.根據權利要求5所述的質粒構建體.其中產生的HPVL1蛋白或多肽形成殼粒。7.根據權利要求5所述的質粒構建體，其中編碼所述多肽的所述目標DNA分子包括SEQIDNO.2。8.根據權利要求1所述的質粒構建體，其中所述啟動子是Tac啟動子。9.一種藥物組合物，包括：一種或多種權利要求1所述的構建體和藥學上可接受的載體。10.根據權利要求9所述的藥物組合物，其中所述構建體包括HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV-35、HPV45、HPV52和HPV58中的至少一種構建體。11.一種在受試者中誘發對至少一種HPV類型的免疫反應的方法，所述方法包括向所述受試者施用組合物，以及在所述受試者中誘發對至少一種HPV類型的免疫反應，所述組合物包括一種或多種根據權利要求1所述...

【專利技術屬性】
技術研發人員：R·L·加西亞，D·G·梅思雅克，
申請(專利權)人：科羅拉多大學董事會，法人，
類型：發明
國別省市：美國,US