二價重組人乳頭瘤病毒疫苗制造技術

本發明專利技術提供了二價重組人乳頭瘤病毒疫苗，它包括活性成分以及佐劑、可藥用的賦型劑等輔料，其中活性成分包括重組ＨＰＶ的Ｌ１蛋白五聚體，所述ＨＰＶ型為ＨＰＶ６和ＨＰＶ１１。該疫苗能夠預防９５％的尖銳濕疣。本發明專利技術所述的疫苗與目前已有的疫苗相比，質量穩定、成本低廉，適應癥明確，療效顯著。

Two valent recombinant human papilloma virus vaccine

The present invention provides two recombinant human papilloma virus vaccine, which comprises an active ingredient and excipient adjuvant, medicinal agents and other excipients, wherein the active ingredients include recombinant HPV L1 protein five precursor, the HPV type HPV6 and HPV11. The vaccine can prevent 95% of condyloma acuminatum. Compared with the existing vaccine, the vaccine of the invention has the advantages of stable quality, low cost, clear indication and remarkable curative effect.

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及人乳頭瘤病毒感染的預防和治療領域。具體地，本專利技術涉及二價(HPV6和HPV11)重組人乳頭瘤病毒疫苗及其應用。
技術介紹
子宮頸癌(Cervical Cancer)每年直接造成約超過30萬成年女性死亡(國 際衛生組織資料)，成為世界范圍內僅次于乳腺癌的威脅婦女生命健康的第二 號殺手。科學研究證實，導致宮頸癌的罪魁禍首是一種名為人乳頭瘤病毒 (Human Papillomavirus,簡稱HPV)的DM致癌病毒。該病毒主要通過兩 性接觸傳染，專性侵染人體上皮細胞特別是生殖器官，部分病毒攜帶者在反 復感染后表現出多種臨床癥狀。女性受高危險型(HPV16、 HPV18等)病毒感 染后，小部分患者由最初的宮頸細胞學異常，發展成I-Ill的宮頸內皮細胞 瘤樣變(CIN I-III )和浸潤性宮頸癌變(ICC),最終發展成致命的子宮頸癌。 部分低危險型(HPV6、 HPV11)病毒感染可導致男女兩性生殖器官部位的尖銳 濕疣。最新研究表明HPV除了直接導致宮頸癌，還與支氣管肺癌、直腸癌、口 腔癌和皮膚癌有重大關系。根據國際衛生組織WHO的有關資料，除了導致宮 頸癌，HPV感染還可能解釋60y。的皮膚癌，60%的食管癌，50%的肺癌、50 %的乳腺癌、25%的口腔癌等人類重大癌癥。HPV病毒在長期的進化中形成了上百種變異類型，其中HPV16、 HPV18等 13種高危險型確認能夠導致宮頸癌癥。HPV6、 HPV11等低危險型是造成男女 生殖部位尖銳濕疣的關鍵病原體，本專利技術正是針對由HPV6、 HPV11引起的感 染所設計的尖銳濕疣疫苗。專利技術內容(一)要解決的技術問題本專利技術的目的之一是提供二價(HPV6和HPV11)重組人乳頭瘤病毒疫苗；本專利技術的另一目的是提供該重組人乳頭瘤病毒疫苗在制備藥物中的應用。(二)技術方案本專利技術所述的二價重組人乳頭瘤病毒疫苗，它包括活性成分以及佐劑、可藥用的賦型劑、穩定劑等輔料，其特征在于所述的活性成分包括重組HPV 的L1蛋白五聚體，所述HPV型為HPV6和HPV11。所述輔料中的佐劑包括鋁鹽、3-0-去酰化單磷酸類脂(3D-MPL)、脂質A衍生物。所述輔料中的賦型劑包括生理鹽水及其它藥物上可接受的賦型劑。 所述輔料中的穩定劑包括基于磷酸鹽的生理緩沖液。 所述重組HPV6L1、 HPV11 Ll蛋白五聚體的含量均為20-50jug/支疫苗。本專利技術所述的疫苗還可包括HPV6和HPV11的L2蛋白、其它能與HPV6 和HPV11L1蛋白五聚體結合的蛋白，例如HPV6和HPV11的E6/E7蛋白。一種生產所述疫苗的方法，它包括如下步驟(1) 表達、分離、純化重組HPV6和HPV11的Ll蛋白五聚體；(2) 將所得L1蛋白五聚體與輔料混合制劑，得到二價重組人乳頭瘤病 毒疫苗。其中，表達、分離、純化重組HPV6、 HPV11L1蛋白五聚體的具體方法 參見專利PCT/CN2008/000314、 CN200810055700.5,得到純度為95%以上的 Ll蛋白五聚體。本專利技術公開了所述疫苗在制備用于預防和/或治療由HPV6、 HPV11引起 的感染和疾病的藥物中的應用。本專利技術還公開了所述疫苗在制備用于預防和/或治療由于抗體交叉反應 而由HPV6、 HPV11以外的其它一種或多種HPV型引起的感染和疾病的藥物 中的應用。前述的感染和疾病包括子宮頸癌、尖銳濕疣、乳腺癌、支氣管肺癌、直腸癌、食道癌、咽癌、口腔癌、皮膚癌及其它與HPV密切相關的疾病。優選地，所述的感染和疾病是尖銳濕疣。 本專利技術所述的疫苗可釆用多種方法作用于人體，包括肌肉和皮下注射。該疫苗在能引發對L1蛋白免疫反應的有效劑量范圍內使用。用于增強免疫反應的復合物的特定劑量依照Ll復合物不同而變化。 一般而言，Ll五聚體的用量在l-5pg/Kg體重之間。上述劑量范圍并不排除更高或更低劑量的可能。例如，具體的劑量會根據是否伴隨有其他藥物劑量而定，或取決于個人的藥代動力學、藥物積累和代謝速率。 (三)有益效果本專利技術所述的該疫苗能夠預防95%的尖銳濕疣。該疫苗的活性成分為 HPV6和HPV11 Ll蛋白的五聚體，該五聚體與HPV Ll蛋白的VLP (類病毒顆 粒，為HPVL1蛋白的七十二聚體)具有相同的免疫原性和抗原性，且相對于 VLP而言具有結構更穩定、工業成本大幅降低的優點。本專利技術所述的疫苗與 目前已有的疫苗相比，質量穩定、成本低廉，適應癥明確，療效顯著。具體實施例方式以下實施例用于說明本專利技術，但不用來限制本專利技術的范圍。實施例l 二價重組人乳頭瘤病毒疫苗的制備以下步驟中涉及的基因克隆、修飾等的操作參見PCT/CN2008/000314、 CN200810055700. 5。一、HPV6 Ll五聚體的制備1、 克隆HPV6 Ll衣殼蛋白基因，克隆到T-Easy vector質粒(購自美國 Promega生物試劑公司)上。2、 修飾HPV6L1衣殼蛋白基因，并在大腸桿菌中表達將含有堿基替代 突變的載有HPV6 Ll基因插入片段的表達質粒pGEX-6-l通過熱激法導入大腸 桿菌BL21細胞之后，使用LB培養基(配方見《分子克隆》第三版，科學出版 社，2002年8月出版)進行攝氏37度培養，菌種接入后生長12小時開始用表達誘導劑IPTG (購自美國Promega公司)誘導，9小時后收獲細胞，細胞用Niro Soavi NS2006型高壓勻質機在800bar下重復破碎細胞2次，顯微鏡檢查細胞破 碎率達到90%以上。3、 HPV6L1蛋白五聚體的分離、純化上清溶液中的L1蛋白經親和色譜 純化蛋白預裝谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂(Amersham公司生產的Glutathione Sepharose 4 B)色譜柱，取濃度為50%的Glutathione Sepharose 4 B句漿 放入色譜柱中(每200ml蛋白清液需要5-10ml勻漿)。用5-10倍的柱床體積的 緩沖液A(組分為50畫l/LTric-HC1, 200畫ol/L NaCl， lmmol/L EDTA ， pH 8.0)洗滌樹脂，將蛋白清液加入色譜柱中，與樹脂混合均勻并在室溫下作用 20分鐘后放出濾過液，用10倍柱床體積的緩沖液A洗滌樹脂柱。用電鏡觀察純 化產物，得到HPV6 Ll的五聚體。二、 HPV11 Ll五聚體的制備:方法同HPV6 Ll五聚體的制備,得到HPVll Ll的五聚體。三、 活性成分與輔料混合將純化的HPV16 Ll的五聚體與含有100mM NaCl 的標準磷酸緩沖液(見《分子克隆實驗指南》第三版，)通過緩沖液置換(buffer exchange,見《分子克隆實驗指南》第三版)方式混合，使得L1五聚體保存 在pH值為7. 2的磷酸緩沖液中，通過調整使得重組HPV6 Ll蛋白五聚體的含 量為40iug/支疫苗，重組HPVllLl蛋白五聚體的含量為40iug/支疫苗，制劑 成為二價重組人乳頭瘤病毒疫苗，在4'C保存。實施例2 二價重組人乳頭瘤病毒疫苗的制備以下步驟中涉及的基因克隆、修飾等的操作參見PCT/CN2008/000314、 CN200810055700, 5。一、HPV6 Ll五聚體的制備1、 克隆HPV6 Ll衣殼蛋白基因，克隆到T-Easy v本文檔來自技高網...

【技術保護點】
二價重組人乳頭瘤病毒疫苗，它包括活性成分以及佐劑、可藥用的賦型劑、穩定劑等輔料，其特征在于所述的活性成分包括重組ＨＰＶ的Ｌ１蛋白五聚體，所述ＨＰＶ型為ＨＰＶ６和ＨＰＶ１１。

【技術特征摘要】
1、二價重組人乳頭瘤病毒疫苗，它包括活性成分以及佐劑、可藥用的賦型劑、穩定劑等輔料，其特征在于所述的活性成分包括重組HPV的L1蛋白五聚體，所述HPV型為HPV6和HPV11。2、 根據權利要求1所述的疫苗，其特征在于所述輔料中的佐劑包括 鋁鹽、3D-MPL、脂質A衍生物。3、 根據權利要求l所述的疫苗，其特征在于所述輔料中的穩定劑包括基 于磷酸鹽的生理緩沖液。4、 根據權利要求1所述的疫苗，其特征在于所述重組HPV6L1、 HPV11 Ll蛋白五聚體的含量均為20 - 50 ju g/支疫苗。5、 一種生產如權利要求1-4之任一所述疫苗的方法，它包括如下步驟:(1) 表達、分離、純化重組HPV6和HPV...

【專利技術屬性】
技術研發人員：馬潤林，陳小江，
申請(專利權)人：北京康樂衛士生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：11[中國|北京]