人乳頭狀瘤病毒的快速基因型鑒定分析及其裝置制造方法及圖紙

本發明專利技術公開一種用于快速基因型鑒定的方法和裝置，在一個實施例中，本發明專利技術被應用到人乳頭狀瘤病毒（HPV）的基因型鑒定，包括使用病毒基因型特異性寡核苷酸探針、反向斑點雜交基因型點陣方式和導流雜交過程，從而提供一種更高效、更快速和更經濟的方法進行HPV基因型鑒定。這種基因型鑒定的方法可以兼容通用探針，從而擴大了HPV基因型的檢測范圍。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】人乳頭狀瘤病毒的快速基因型鑒定分析及其裝置本申請要求2010年4月29日提交的美國專利申請序號12/770034的優先權，該申請是部份接續2006年4月4日提交的美國專利申請序號11/398433，而后者是部分接續 2002年11月7日提交的美國專利申請序號10/291168，同時該申請聲明要求2001年11月 7日提交的美國專利申請序號60/345948的權益。美國專利申請序號11/398433也是部分延續2002年11月9號提交的美國專利申請序號10/293248。前述申請內容特此全文并入本申請中作為參考。
本專利技術是關于鑒定人乳頭狀瘤病毒的多種基因型。
技術介紹
鑒定人類白細胞抗原(HLA)在器官或骨髓移植中，通過準確的HLA分型使得供體和受體相匹配(4)，是預防急性移植物抗宿主病(GVHD)發生的關鍵。HLA分型通常是通過標準血清學分型(2)來完成。最近的研究表明，DNA分型提供的結果更加準確和肯定(7，9，8)。將HLA-DQ、HLA-DR和HLA-DP 分型檢測結果用于高精度匹配，這已是選擇潛在器官捐獻者的必備途徑(3)。先前已有報道，利用序列特異性引物的聚合酶鏈反應(SSP-PCR)擴增，可進行HLA基因分型。然而，由于 HLA-DQ、DR和DP位點的高度多態性，所需序列特異性引物(SSP)的數目將會多達數百個， 超出了多重PCR擴增極限，從而無法進行有效的PCR擴增。要確保HLA基因分型的結果在臨床上有實際應用，必須設置多項檢測，每項各有50至100個獨立的PCR反應。如今市場上提供一種試劑盒，其中包括一個擴增過程，需要進行96個獨立的PCR反應，然后對凝膠電泳分離得到的片段大小進行分析。這不僅耗費時間和金錢，而且非常容易出現差錯，因為反應設置復雜，另外判斷凝膠電泳中片段大小也存在不確定性。因此，DNA測序仍然被認為是 HLA基因準確分型的首選方法。遺憾的是，由于在序列上高度同源，假基因也可以在聚合酶鏈反應(PCR)中被共同擴增，使得單獨通過DNA測序進行高分辨HLA基因分型將會更加困難并且昂貴。授予JWO Tam先生的美國專利第5471547和6020187號，公開了一種可以在費用低廉的設備上進行的快速退火過程，用于準確的突變型檢測、基因分型和指紋圖譜分析。 本專利技術公開了一種使用改進的導流方式，利用ASO寡核苷酸探針對HLA基因座DP、DR和DQ beta序列進行快速分析的方法。DNA指紋圖譜快速鑒定人類和生物體1985年，基于限制性片段長度多態性(RFLP)的DNA指紋圖譜首次應用于人類身份鑒定(12)，并隨后開始應用于其他生物體的鑒定。在實際應用中，DNA指紋技術作為最好的法醫學工具已經被廣泛接受，可用于在刑事案件中確定犯罪嫌疑人、親子糾紛、建立或證實一個人的身份。耗時的RFLP方法已逐漸被高通量的自動化過程取代。目前，利用PCR 擴增，分析人類基因組10、16、18或更多位點上的短串聯重復序列(STR)的數目(1991年發現(11))，已經實現了單細胞水平的鑒定。但是，不論STR還是可變數目的串聯重復序列3(VNTR)，都相對昂貴，因為這些方法需要使用復雜的設備，以及人工密集并且過程耗時的方法，比如Southern印跡雜交。自發突變(10)也可能會降低準確性和最終鑒定結果的確定性。此外，STR數據表明，突變的頻率，特別是在癌癥患者中，并不鮮見。因此，需要找到新的替代方法。單核苷酸多態性(SNP)基因型鑒定是在法醫或個人身份識別中一種分辨率更高的方法，這種方法基于在不連鎖位點上選擇一定數量的SNP位點，其中每個位點的突變頻率均低于VNTR或STR系統。本專利技術展示了一種利用SNP基因型鑒定的方法，快速、明確鑒定個體生物特征，包括人、動物、植物或其他生物。HPV基因型鑒定人乳頭狀瘤病毒(HPV)攻擊粘膜細胞，具有高度多樣性，世界范圍內已報道的有大約200種不同的基因型，在不同種群中患病率各不相同。根據導致疾病的嚴重程度，人乳頭狀瘤病毒分為高風險株(HR)和低風險株(LR)。HR類型較常出現在宮頸的癌前病變或惡性病變，而LR類型多為良性病例(4)。每年有大約50萬宮頸癌新發病例，死亡病例預計超過 25萬。因此，HPV感染與宮頸癌仍然是威脅全球女性的主要癌癥(5)。基于這個原因，HPV 篩查建議用于預防宮頸癌，因為它比細胞學方法更敏感(6，7)。臨床研究顯示，99. 7%的子宮頸癌與HR-HPV感染有關。盡管在大多數感染病例中，HPV可能會被清除，但是持續的HR-HPV感染，會導致重度宮頸上皮內瘤樣病變(如 CIN IXIN II或CIN III)，并發展成為子宮頸癌(7，8)。因此，針對HPV病毒DNA的分析方法，已被開發并推向市場。美國食品藥品監督局已經批準了 Hybrid capture 2 (HC2)系統 (Digene公司，美國馬里蘭州Gaithersburg)和AMPLICOR HPV測試(羅氏分子診斷，美國新澤西州Branchburg)。這些篩查測試確定的是常見的HPV (HR株或LR株)是否存在，而無法區分其基因型。雖然這些測試提供了良好的HPV篩查檢測，但是無法進行HPV的基因型鑒定限制了它們在臨床診斷和預后中的應用，因為不同毒株引起疾病的嚴重程度有很大的不同，其中16型導致病癥最為嚴重，緊隨其后的是18型、33型、45型和59型等(8)。此外持續感染相同基因型的HPV，將進一步增加子宮頸癌的風險(9)。因此，有效和費用可接受的HPV基因型鑒定檢測方法是最需要的。LINEAR ARRAY HPV基因型檢測(羅氏分子診斷，美國新澤西州Branchburg，涵蓋37 種基因型)和INNO-LIPA HPV基因型鑒定(Innogenetics公司，比利時，涵蓋28種基因型)， 可以作為HC2或AMPLICOR HPV測試的補充，用于區分特定HPV基因型，并確定涉及多個HPV 基因型的感染?；谙铝惺聦?)不同HR-HPV毒株的致癌性不同；2)相同基因型的持續性感染導致風險升高；3)已有的HPV疫苗不能防止所有類型的HPV感染，除了確定HPV病毒存在與否的常規篩查，HPV基因型鑒定仍然是需要的。然而，上述測試非常昂貴，并且仍然使用傳統的雜交過程，需要較高的運行成本和人工操作時間。最重要的是，這些基因型鑒定試劑盒不能檢測超出預先設定的基因型譜，因此在HPV篩查中產生較高的假陽性率。因此， HPV基因型檢測方法需要實現更快捷、更便宜、覆蓋更多的基因型，并因此更高效，作為目前 HPV檢測的可負擔的替代方法。專利技術概要HLA基因型鑒定初步結果表明，在檢測特定目標HLA的DNA序列時，等位基因特異性寡核苷酸反相斑點印跡(ASO-RDB)導流雜交是一種更好的選擇。由其獲得的數據代表HLA-DP、DR和DQ beta位點上的特征片段，因而能夠準確地鑒定基因型。使用一對PCR引物和35個ASO寡核苷酸探針，可以將世界衛生組織(WHO)確定的83個DPBl等位基因進行有效的分類。同樣，使用一對相同的PCR引物和18個ASO寡核苷酸探針，這個簡單的雜交方法可以識別DR 和DQ beta位點特定基因型的頭兩位編碼，足以區分這些主要人類白細胞抗原。ASO數據通過直接測序法進行驗證。但是，本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：譚約瑟夫榮安，周約瑟夫，陳里斯卓宇，
申請(專利權)人：達雅高生物科技有限公司，
類型：
國別省市：