一種預防和治療人乳頭瘤病毒感染類疾病的化合物及其篩選方法技術

本發明專利技術公開了一種預防和治療人乳頭瘤病毒(HPV)感染類疾病的化合物的篩選方法，該方法采用基于結構的計算機輔助藥物設計，以人乳頭瘤病毒E1解旋酶結構為基礎進行篩選，得到能抑制E1的候選化合物；上述篩選方法具有方便、省時、高效的安捷倫液質分析培訓特點；本發明專利技術還公開了利用上述篩選方法得到的化合物，如曲伐沙星及其衍生物、加替沙星及其衍生物，這些人乳頭瘤病毒E1解旋酶的抑制劑具有特異性高、針對性強的特點，有助于預防和治療人乳頭狀瘤病毒感染，以及和HPV感染有關的疾病，如子宮頸癌和生殖器疣等疾病。

【技術實現步驟摘要】
預防和治療人乳頭瘤病毒感染類疾病的化合物的篩選方法
本專利技術涉及治療和預防人乳頭瘤病毒感染和子宮頸癌相關的領域，尤其在設計和使用的E1解旋酶抑制劑，以預防或治療HPV相關宮頸癌和其他疾病。
技術介紹
子宮頸癌(CervicalCancer)是世界范圍內僅次于乳腺癌的威脅婦女生命健康的第二號殺手(國際衛生組織資料)，每年造成約超過30萬成年女性因患子宮頸癌而死亡。目前已證實導致宮頸癌的病因是人乳頭瘤病毒(HumanPapillomavirus，簡稱HPV)的DNA致癌病毒的侵染所致。該病毒主要通過兩性接觸傳染，專性侵染人體上皮細胞特別是生殖器官，部分病毒攜帶者在反復感染后表現出多種臨床癥狀。女性受高危險型(HPV16、HPV18等)病毒感染后，小部分患者由最初的宮頸細胞學異常，發展成I-III的宮頸內皮細胞瘤樣變(CINI-III)和浸潤性宮頸癌變(ICC)，最終發展成致命的子宮頸癌。HPV病毒在長期的進化中形成了上百種變異類型，其中HPV16、HPV18等13種高危險類型，已被確認能夠導致宮頸癌癥。部分低危險型(HPV6、HPV11等)病毒感染可導致男女兩性生殖器官部位的尖銳濕疣。HPV除了直接導致宮頸癌，新的研究資料也提供了證據，HPV的感染很可能和支氣管肺癌、直腸癌、口腔癌和皮膚癌等癌癥有著緊密的關系。根據國際衛生組織WHO的有關資料，除了導致宮頸癌，HPV感染還可能和60％的皮膚癌，60％的食管癌，50％的肺癌、50％的乳腺癌、25％的口腔癌等人類重大癌癥的發病相關。目前國內外還沒有任何有效的預防和治療人乳頭瘤病毒的化合物，主要是由于很難通過常規的手段(如普遍撒網的高通量篩選等)找到針對改該病毒的具有高特異性高的抑制劑化合物。而由于我們對人乳頭瘤病毒侵染毒繁殖所必須的解旋酶的分子結構和分子機理的掌握和了解，我們可以通過對分子結構進行計算機的模擬和分析，并通過以結構為基礎的分子對接用計算機對大分子庫進行有效的篩選，從而能從幾十萬到上百萬的分子庫中很快的選出能結合目標蛋白的少數的化合物，從而通過試驗篩選很快驗證和確定具有對目標蛋白具有高特異性的抑制功能的化合物。
技術實現思路
本專利技術的目的是針對現有技術中的上述缺陷，提出一種方便、省時、高效的預防和治療人乳頭瘤病毒感染類疾病的化合物的篩選方法，并提供了通過上述篩選方法篩選出來的特異性高、針對性強的預防和治療人乳頭瘤病毒感染類疾病的化合物，由其指出了其在預防和治療HPV感染、子宮頸癌及尖銳濕疣等疾病上的應用。實現上述目的的技術方案如下：一種預防和治療人乳頭瘤病毒感染類疾病的化合物的篩選方法，采用基于結構的計算機輔助藥物設計方法，以人乳頭瘤病毒E1解旋酶結構為基礎進行篩選，得到能抑制E1的候選化合物。進一步地，所述的以人乳頭瘤病毒E1解旋酶結構為基礎包括：(a)一個由原子坐標確定下來的E1蛋白分子結構和由E1形成的六聚體的結構；(b)一個由原子坐標確定下來的E1蛋白分子與ATP或ADP相結合的復合體結構；(c)一個E1蛋白單獨的結構或與一個化合物或多肽結合的復合體結構。進一步地，上述篩選方法還包括E1解旋酶功能檢測，所述E1解旋酶功能檢測方法采用電泳遷移率試驗。本專利技術還提供了利用上述篩選方法得到的預防和治療人乳頭瘤病毒感染類疾病的化合物，所述化合物為曲伐沙星及其衍生物、加替沙星及其衍生物。進一步地，本專利技術所述的人乳頭瘤病毒感染類疾病包括子宮頸癌或尖銳濕疣。即本專利技術主要是使用乳頭瘤病毒E1解旋酶的三維分子結構，來設計和篩選特異性的E1抑制劑，用作治療和預防HPV感染及相關的宮頸癌和尖銳濕疣的藥物。本專利技術所述闡明了一個通過結構和計算分析設計，以及試驗篩選的方法來找到針對E1分子靶點的有效抑制劑化合物。這些化合物結合在E1分子空間結構的不同的點，用于破壞E1自身的功能，阻斷E1與DNA，與三磷酸腺苷，以及與E2的相互作用，所有這些都是E1對病毒基因組復制必不可少的功能。本專利技術提供了對抑制E1功能的抗HPV病毒分子藥物的設計，篩選，識別和檢測的方法，同時還提供對這類抑制劑化合物在預防和治療病毒感染和癌癥(包括但不限于在HPV感染和宮頸癌和尖銳濕疣上使用這些化合物)中的應用。本專利技術主要是基于以下原理進行相關化合物篩選的：HPV是DNA病毒，病毒的基因是DNA。病毒進入人體上皮細胞后，其DNA基因必須在細胞內復制，才能完成病毒的繁殖和侵染，而病毒DNA基因的復制必須要HPV病毒的解旋酶，即E1蛋白，來打開病毒DNA雙鏈。同時，HPVE1和HPVE2蛋白的結合和相互作用也對病毒DNA的復制啟動有著關鍵的作用，因而，HPVE1和HPVE2也稱DNA復制啟動子。上述HPVE1蛋白的功能為；ATP酶和DNA解旋酶；以六倍復合體的形式識別并結合在DNA復制的病毒起源點；它是病毒DNA復制所必需的。HPVE2蛋白的功能為：病毒基因轉錄的主要調節因子；以二聚物的形式與病毒轉錄引物結合；參與病毒DNA復制過程；與E1相互作用并使E1補充到病毒復制起源點。人乳頭瘤病毒的復制，需要有幾個不同的生物活性環節，包括由病毒的DNA解旋酶E1把病毒的DNA雙鏈打開，并以此作為復制模板由細胞的聚合酶啟動DNA復制引物。E1解旋酶的突變或E1酶的抑制化合物可導致病毒DNA復制失敗，阻斷病毒的復制，以達到預防和抑制HPV病毒的侵染，從而預防和治療子宮頸癌的效果。人乳頭瘤病毒E1解旋酶和人體細胞的解旋酶(稱MCM)幾乎沒有氨基酸序列的保守性，MCM解旋酶是人體細胞染色體復制所需的酶。HPVE1和MCM在立體結構上有著根本的不同(Brewsteretal，PNAS，2008)。由于E1的解旋酶對HPV病毒的復制是必不可少的，而E1和MCM解旋酶的序列和結構都不同，這樣，E1解旋酶提供了一個極好的特異性很高的防病毒的藥物靶點。因為E1是針對病毒的高特異性分子靶標，針對E1的藥物可以有助于降低對人體細胞的毒性。由于解析出了HPVE1蛋白分子的晶體結構，我們能夠通過分子結構的分析和建立分子結構模型來設計和開發E1酶的有效的抑制劑作為抗病毒和抗子宮癌的小分子藥物。這些E1酶的有效小分子抑制劑同時也可作為分子工具，用來進一步研究解旋酶的功能和調控機制。到目前為止，尚無任何有效的藥物來抑制人乳頭狀瘤HPV病毒的復制，侵染和繁殖。針對人乳頭狀瘤病毒E1解旋酶的小分子藥物，是一種全新的抑制HPV病毒復制的有效藥物。根據在此顯示的E1和核苷酸ATP和ADP)復合體的原子結構模型，我們能夠通過對結構模型的詳細的計算分析，來幫助我們設計E1解旋酶的小分子抑制劑，以便達到對E1本身活性的抑制，或對E1與DNA或與E2或其它DNA復制蛋白的相互結合的抑制，從而能有效地抑制HPV病毒的復制，可用于治療HPV感染以及相關的子宮頸癌和尖銳濕疣等疾病。下面對本專利技術中涉及的基于結構的計算機輔助藥物設計的結構基礎-人乳頭瘤病毒E1解旋酶結構作進一步的介紹：本專利技術所指的人乳頭狀瘤病毒(HPV)E1蛋白是指包含50個或更多氨基酸的E1多肽序列，或更長的E1，包括全長E1蛋白，E1本身，或作為E1融合蛋白。一個同源蛋白的蛋白質，包括不是天然出現的蛋白質，并且有一個或幾個氨基酸，但不局限于一個或幾個氨基酸的不同或被刪除(例如，蛋白質截斷的片本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種預防和治療人乳頭瘤病毒感染類疾病的化合物的篩選方法，其特征在于，采用結構計算機輔助藥物設計方法，以人乳頭瘤病毒E1解旋酶結構為基礎進行篩選，得到能抑制E1的候選化合物。

【技術特征摘要】
1.一種預防和治療人乳頭瘤病毒感染類疾病的化合物曲伐沙星、加替沙星的篩選方法，其特征在于該方法為：采用結構計算機輔助藥物設計方法，以人乳頭瘤病毒E1解旋酶結構為基礎進行篩選，所述人乳頭瘤病毒E1解旋酶結構為：一個由原子坐標確定下來的E1蛋白分子結構和由E1形成的六聚體的結構；所述結構計算機輔助藥物設計方法為：1)E1蛋白結晶：牛乳頭瘤病毒E1蛋白結晶是用20mg/ml的蛋白濃度，在含有pH7.5100mMMES，pH7.5300mMKPO4，190mMNaCl，8％PEG6K的溶液里，用懸滴氣相擴散法，在18度的條件下進行；2)結晶的晶包常數為：p212121，a＝133.211，b＝179.192，和c＝185.350，α＝β＝g＝90；晶體衍射分辨率為3.1埃；3)E1的六聚體的總體結構如圖5(A、B)所示，E1亞基組裝成有一中央通道的同源六聚結構；從側面看，六聚體環顯示為兩個不同直徑的環，即在頂部小環和底部大環；這兩個層次的...

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳小江，陳林，李大偉，樓慧強，
申請(專利權)人：小江生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：