用于修飾所靶向基因座的方法和組合物技術

本發明專利技術提供了用于修飾細胞中的一個或多個靶基因座的方法和組合物。此類方法包括提供包含第一多核苷酸的細胞，所述第一多核苷酸編碼第一選擇標記并有效連接至所述細胞中有活性的第一啟動子，其中所述第一多核苷酸還包含第一核酸酶試劑的第一識別位點。向細胞中引入第一核酸酶試劑，其中所述第一核酸酶試劑在所述第一識別位點處誘導切口或雙鏈斷裂。進一步向細胞中引入包含第一插入多核苷酸的第一靶向載體，所述第一插入多核苷酸側接第一同源臂和第二同源臂，所述第一同源臂和第二同源臂與位于足夠接近第一識別位點處的第一靶位點和第二靶位點相對應。然后鑒定在其基因組中包含在所述靶基因座處整合的所述第一插入多核苷酸的至少一個細胞。

Methods and compositions for modifying a targeted gene locus

The present invention provides methods and compositions for modifying one or more target gene loci in cells. The method includes providing a polynucleotide comprising a first cell, the first marker and polynucleotide for encoding the first connected to the first promoter activity of the cells, wherein the first polynucleotide also contains the first recognition sites the first nucleic acid enzyme reagent. A first nuclease reagent is introduced into a cell, wherein the first nuclease reagent induces an incision or double strand break at the first identification site. Further to the cell containing the first target into the first insertion of polynucleotide to the carrier, the first side is connected to a first insertion polynucleotide homologous arms and second homologous arms, the first homologous arm and second homologous arms corresponding to the first recognition site is located close enough to the first target sites and second target sites. At least one cell in the genome of the first inserted polynucleotide integrated in the genome of the target gene is identified.

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】用于修飾所靶向基因座的方法和組合物相關申請的交叉引用本申請要求2014年6月6日提交的美國臨時申請No.62/008,832以及2014年6月27日提交的美國臨時申請No.62/017,916的權益，這兩個美國臨時申請均據此全文以引用的方式并入本文中。
所述方法和組合物涉及分子生物學領域。具體地講，本專利技術提供了用于修飾細胞中所靶向基因座的方法和組合物。作為通過EFSWEB提交的文本文件通過EFS-Web以電子方式將序列表的正式文本作為ASCII格式的序列表提交，該文件名稱為461003SEQLIST.TXT，創建日期為2015年6月5日，文件大小為5KB，并且該文件與本說明書同時提交。該ASCII格式文檔中所含的序列表是本說明書的一部分，并且全文以引用的方式并入本文中。
技術介紹
使用被特別設計成在基因組座位處添加、缺失或取代特定核酸序列的靶向載體進行的同源重組，是在細胞中實現所需基因組修飾的常用方法。可將被特別改造成在靶基因座處或其附近引入切口或雙鏈斷裂的核酸酶與靶向載體聯合使用，以增強靶基因座處同源重組的效率。雖然通過同源重組進行靶向修飾的領域在過去二十年內已取得顯著進展，但使用靶向載體實現可接受的靶向效率仍然存在困難。需要能夠提高產生靶向修飾的功效和效率的方法。
技術實現思路
本專利技術提供了用于修飾細胞中一個或多個靶基因座的方法和組合物。在一些實施例中，提供了用于修飾細胞中靶基因座的方法，所述方法包括：(a)提供包含靶基因座的細胞，所述靶基因座包含編碼第一選擇標記并有效連接至細胞中有活性的第一啟動子的第一多核苷酸，其中所述第一多核苷酸還包含第一核酸酶試劑的第一識別位點，(b)向細胞中引入(i)第一核酸酶試劑，其中所述第一核酸酶試劑在第一識別位點處誘導切口或雙鏈斷裂；和(ii)包含第一插入多核苷酸的第一靶向載體，所述第一插入多核苷酸側接第一同源臂和第二同源臂，所述第一同源臂和第二同源臂與位于足夠接近第一識別位點處的第一靶位點和第二靶位點相對應；以及(c)鑒定包含在靶基因座處整合的第一插入多核苷酸的至少一個細胞。在一些實施例中，用于修飾細胞中的靶基因座的方法包括：(a)提供包含第一靶基因座的細胞，所述第一靶基因座包含編碼第一選擇標記并有效連接至第一啟動子的第一多核苷酸，其中所述第一多核苷酸還包含第一核酸酶試劑的第一識別位點，(b)向細胞中引入：(i)編碼第一核酸酶試劑并有效連接至細胞中有活性的啟動子的一個或多個表達構建體，其中所述第一核酸酶試劑在第一多核苷酸中的第一識別位點處誘導切口或雙鏈斷裂，從而破壞第一選擇標記的表達或活性；和(ii)包含第一插入多核苷酸的第一靶向載體，所述第一插入多核苷酸包含編碼第二選擇標記并有效連接至第二啟動子的第二多核苷酸，其中所述第一插入核酸側接第一同源臂和第二同源臂，所述第一同源臂和第二同源臂與位于第一靶基因座中的第一靶位點和第二靶位點相對應；以及(c)鑒定在第一靶基因座處包含第一插入核酸的修飾細胞，其中所述修飾細胞具有第二選擇標記的活性，但不具有第一選擇標記的活性，并且其中所述第一選擇標記和第二選擇標記不同。在一個實施例中，靶基因座位于細胞的基因組中。在另一個實施例中，靶基因座位于細胞中的載體中。在一個實施例中，第一識別位點處的切口或雙鏈斷裂破壞第一選擇標記的活性。在又一個實施例中，鑒定步驟(c)包括在允許鑒定沒有第一選擇標記活性的細胞的條件下培養細胞。在一個實施例中，包含第一選擇標記的第一多核苷酸側接第一靶位點和第二靶位點。在一個實施例中，鑒定步驟(c)包括鑒定包含在第一靶位點和第二靶位點處整合的第一插入多核苷酸的至少一個細胞。在一個實施例中，第一插入多核苷酸包含：(a)第一目標多核苷酸；和(b)編碼第二選擇標記并有效連接至細胞中有活性的第二啟動子的第二多核苷酸，其中所述第二多核苷酸包含第二核酸酶試劑的第二識別位點。在一個實施例中，所述方法還包括(a)向包含在靶基因座處整合的第一插入多核苷酸的細胞中引入(i)第二核酸酶試劑，其中所述第二核酸酶試劑在第二識別位點處誘導切口或雙鏈斷裂；和(ii)包含第二插入多核苷酸的第二靶向載體，所述第二插入多核苷酸側接第三同源臂和第四同源臂，所述第三同源臂和第四同源臂與位于足夠接近第二識別位點處的第三靶位點和第四靶位點相對應；以及(b)鑒定包含在靶基因座處整合的第二插入多核苷酸的至少一個細胞。在一個實施例中，第二識別位點處的切口或雙鏈斷裂破壞第二選擇標記的活性。在一個實施例中，鑒定步驟(b)包括在允許鑒定沒有第二選擇標記的活性的細胞的條件下培養細胞。在一個實施例中，包含第二選擇性標記的第二多核苷酸側接第三靶位點和第四靶位點。在一個實施例中，鑒定步驟(b)包括鑒定包含在第三靶位點和第四靶位點處整合的第二插入多核苷酸的至少一個細胞。在一個實施例中，第二插入多核苷酸包含：(a)第二目標多核苷酸；和(b)編碼第三選擇標記并有效連接至細胞中有活性的第三啟動子的第三多核苷酸，其中所述第三多核苷酸包含第三核酸酶試劑的第三識別位點。在一個實施例中，第一核酸酶試劑與第二核酸酶試劑不同。在一個實施例中，第一選擇標記與第二選擇標記不同。在一個實施例中，第一核酸酶識別位點和第三核酸酶識別位點彼此相同并與第二核酸酶識別位點不同；并且第一核酸酶試劑和第三核酸酶試劑彼此相同并與第二核酸酶試劑不同。在一個實施例中，第一選擇標記和第三選擇標記相同。在一個實施例中，第一選擇標記、第二選擇標記或第三選擇標記中的一者賦予對抗生素的抗性。在一個實施例中，抗生素包括G418、潮霉素、殺稻瘟菌素、新霉素或嘌呤霉素。在一個實施例中，第一選擇標記、第二選擇標記或第三選擇標記中的一者有效連接至誘導型啟動子，并且選擇性標記的表達對細胞有毒性。在一個實施例中，第一選擇標記、第二選擇標記或第三選擇標記包括次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT)或單純性皰疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)。在一個實施例中，所述細胞為原核細胞。在一個實施例中，所述細胞為真核細胞。在一個實施例中，所述真核細胞為哺乳動物細胞。在一個實施例中，所述哺乳動物細胞為非人哺乳動物細胞。在一個實施例中，所述哺乳動物細胞來自嚙齒動物。在一個實施例中，所述嚙齒動物為大鼠或小鼠。在一個實施例中，所述細胞為多能細胞。在一個實施例中，所述哺乳動物細胞為人誘導性多能干(iPS)細胞。在一個實施例中，所述多能細胞為非人胚胎干(ES)細胞。在一個實施例中，所述多能細胞為小鼠胚胎干(ES)細胞或大鼠胚胎干(ES)細胞。在一個實施例中，所述多能細胞為造血干細胞。在一個實施例中，所述多能細胞為神經元干細胞。在一個實施例中，所述哺乳動物細胞為人成纖維細胞。在一個實施例中，與單獨使用第一靶向載體相比，聯合使用第一靶向載體與第一核酸酶試劑會提高靶向效率。在一個實施例中，與單獨使用第一靶向載體相比，第一靶向載體的靶向效率提高了至少2倍。在一個實施例中，第一核酸酶試劑或第二核酸酶試劑包括表達構建體，所述表達構建體包含編碼核酸酶試劑的核酸序列，并且其中所述核酸有效連接至細胞中有活性的第四啟動子。在一個實施例中，第一核酸酶試劑或第二核酸酶試劑為編碼核酸酶的mRNA。在一個實施例中，第一核酸酶試劑或第二核酸酶試劑為鋅指核酸酶(ZFN)。在一個實施例中，本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于修飾細胞中的靶基因座的方法，包括：(a)提供包含第一靶基因座的細胞，所述第一靶基因座包含編碼第一選擇標記并有效連接至第一啟動子的第一多核苷酸，其中所述第一多核苷酸還包含第一核酸酶試劑的第一識別位點，(b)向所述細胞中引入：(i)編碼第一核酸酶試劑并有效連接至所述細胞中有活性的啟動子的一個或多個表達構建體，其中所述第一核酸酶試劑在所述第一多核苷酸中的第一識別位點處誘導切口或雙鏈斷裂，從而破壞所述第一選擇標記的表達或活性；和(ii)包含第一插入多核苷酸的第一靶向載體，所述第一插入多核苷酸包含編碼第二選擇標記并有效連接至第二啟動子的第二多核苷酸，其中所述第一插入核酸側接第一同源臂和第二同源臂，所述第一同源臂和所述第二同源臂與位于所述第一靶基因座中的第一靶位點和第二靶位點相對應；以及，(c)鑒定在所述第一靶基因座處包含所述第一插入核酸的修飾細胞，其中所述修飾細胞具有所述第二選擇標記的活性，但不具有所述第一選擇標記的活性，并且其中所述第一選擇標記和所述第二選擇標記不同。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2014.06.06 US 62/008,832;2014.06.27 US 62/017,9161.一種用于修飾細胞中的靶基因座的方法，包括：(a)提供包含第一靶基因座的細胞，所述第一靶基因座包含編碼第一選擇標記并有效連接至第一啟動子的第一多核苷酸，其中所述第一多核苷酸還包含第一核酸酶試劑的第一識別位點，(b)向所述細胞中引入：(i)編碼第一核酸酶試劑并有效連接至所述細胞中有活性的啟動子的一個或多個表達構建體，其中所述第一核酸酶試劑在所述第一多核苷酸中的第一識別位點處誘導切口或雙鏈斷裂，從而破壞所述第一選擇標記的表達或活性；和(ii)包含第一插入多核苷酸的第一靶向載體，所述第一插入多核苷酸包含編碼第二選擇標記并有效連接至第二啟動子的第二多核苷酸，其中所述第一插入核酸側接第一同源臂和第二同源臂，所述第一同源臂和所述第二同源臂與位于所述第一靶基因座中的第一靶位點和第二靶位點相對應；以及，(c)鑒定在所述第一靶基因座處包含所述第一插入核酸的修飾細胞，其中所述修飾細胞具有所述第二選擇標記的活性，但不具有所述第一選擇標記的活性，并且其中所述第一選擇標記和所述第二選擇標記不同。2.根據權利要求1所述的方法，其中所述靶基因座位于所述細胞的基因組中。3.根據權利要求1所述的方法，其中所述靶基因座位于所述細胞中的載體中。4.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述鑒定步驟(c)包括在允許鑒定沒有所述第一選擇標記的活性的細胞的條件下培養所述細胞。5.根據權利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述鑒定步驟(c)包括鑒定包含在所述第一靶位點和所述第二靶位點處整合的所述第一插入多核苷酸的至少一個細胞。6.根據權利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述第一插入多核苷酸還包含第一目標多核苷酸。7.根據權利要求6所述的方法，其中編碼所述第二選擇標記的所述第二多核苷酸有效連接至所述細胞中有活性的第二啟動子，并且其中所述第二多核苷酸包含第二核酸酶試劑的第二識別位點。8.根據權利要求7所述的方法，其中所述方法還包括(a)向包含在所述靶基因座處整合的所述第一插入多核苷酸的所述細胞中引入：(i)第二核酸酶試劑，其中所述第二核酸酶試劑在所述第二多核苷酸中的所述第二識別位點處誘導切口或雙鏈斷裂，從而破壞所述第二選擇標記的表達或活性；和(ii)包含第二插入多核苷酸的第二靶向載體，所述第二插入多核苷酸側接第三同源臂和第四同源臂，所述第三同源臂和所述第四同源臂與位于足夠接近所述第二識別位點處的第三靶位點和第四靶位點相對應；以及(b)鑒定包含在所述靶基因座處整合的所述第二插入多核苷酸的至少一個細胞。9.根據權利要求8所述的方法，其中所述鑒定步驟(b)包括在允許鑒定沒有所述第二選擇標記的活性的細胞的條件下培養所述細胞。10.根據權利要求8或9所述的方法，其中包含所述第二選擇性標記的所述第二多核苷酸側接所述第三靶位點和所述第四靶位點。11.根據權利要求10所述的方法，其中所述鑒定步驟(b)包括鑒定包含在所述第三靶位點和所述第四靶位點處整合的所述第二插入多核苷酸的至少一個細胞。12.根據權利要求8-11中任一項所述的方法，其中所述第二插入多核苷酸包括：(a)第二目標多核苷酸；和(b)編碼第三選擇標記并有效連接至所述細胞中有活性的第三啟動子的第三多核苷酸，其中所述第三多核苷酸包含第三核酸酶試劑的第三識別位點。13.根據權利要求7-12中任一項所述的方法，其中所述第一核酸酶試劑與所述第二核酸酶試劑不同。14.根據權利要求7-13中任一項所述的方法，其中所述第一選擇標記與所述第二選擇標記不同。15.根據權利要求12所述的方法，其中所述第一核酸酶識別位點和所述第三核酸酶識別位點彼此相同并與所述第二核酸酶識別位點不同；并且所述第一核酸酶試劑和所述第三核酸酶試劑彼此相同并與所述第二核酸酶試劑不同。16.根據權利要求12所述的方法，其中所述第一選擇標記和所述第三選擇標記相同。17.根據權利要求1-16中任一項所述的方法，其中所述第一選擇標記、所述第二選擇標記或所述第三選擇標記中的一者賦予對抗生素的抗性。18.根據權利要求17所述的方法，其中所述抗生素包括G418、潮霉素、殺稻瘟菌素、新霉素或嘌呤霉素。19.根據權利要求1-16中任一項所述的方法，其中所述第一選擇標記、所述第二選擇標記或所述第三選擇標記中的一者有效連接至誘導型啟動子，并且所述選擇性標記的表達對所述細胞有毒性。20.根據權利要求19所述的方法，其中所述第一選擇標記、所述第二選擇標記或所述第三選擇標記包括次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT)或單純性皰疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)。21.根據權利要求1-20中任一項所述的方法，其中所述細胞為原核細胞。22.根據權利要求1-20中任一項所述的方法，其中所述細胞為真核細胞。23.根據權利要求22所述的方法，其中所述真核細胞為哺乳動物細胞。24.根據權利要求23所述的方法，其中所述哺乳動物細胞為非人哺乳動物細胞。25.根據權利要求24所述的方法，其中所述哺乳動物細胞來自嚙齒動物。26.根據權利要求25所述的方法，其中所述嚙齒動物為大鼠或小鼠。27.根據權利要求23-26中任一項所述的方法，其中所述細胞為多能細胞。28.根據權利要求23所述的方法，其中所述哺乳動物細胞為人誘導性多能干(iPS)細胞。29.根據權利要求27所述的方法，其中所述多能細胞為非人胚胎干(ES)細胞。30.根據權利要求27所述的方法，其中所述多能細胞為小鼠胚胎干(ES)細胞或大鼠胚胎干(ES)細胞。31.根據權利要求27-30中任一項所述的方法，其中所述多能細胞為造血干細胞。32.根據權利要求27-30中任一項所述的方法，其中所述多能細胞為神經元干細胞。33.根據權利要求23所述的方法，其中所述哺乳動物細胞為人成纖維細胞。34.根據權利要求1所述的方法，其中與單獨使用所述...

【專利技術屬性】
技術研發人員：沃基特克·奧爾巴赫，大衛·弗倫杜威，古斯塔沃·德羅格特，安東尼·加戈利亞地，瓊科·庫諾，大衛·M·巴倫蘇埃拉，
申請(專利權)人：瑞澤恩制藥公司，
類型：發明
國別省市：美國,US