使用向導RNA/CAS內切核酸酶系統改變農學性狀及其使用方法技術方案

本發明專利技術提供了組合物和方法以用于植物或植物細胞的基因組中靶序列的農學性狀改變。該方法和組合物使用向導RNA/Cas內切核酸酶系統以提供修飾或改變植物、植物細胞或種子的基因組區域內靶位點的有效系統，從而提供所需的農學性狀諸如干旱、收率和脅迫耐受性的改善。本發明專利技術還公開了利用雙組分RNA向導和Cas內切核酸酶系統來選擇植物的育種方法。本發明專利技術還提供了用于編輯細胞的基因組中核苷酸序列的組合物和方法。

Use the wizard RNA/CAS endonuclease system to alter agronomic traits and how they are used

The present invention provides compositions and methods for agronomic character change in target sequences of plant or plant cells. The methods and compositions using the wizard RNA/Cas endonuclease system to provide an effective system of region of the genome modification or change plants, plant cells or seed in the target site, so as to provide the desired agronomic traits such as drought, yield and stress tolerance improvement. The invention also discloses a breeding method for selecting a plant by using a two-component RNA guide and an Cas endonuclease system. The present invention also provides compositions and methods for editing nucleotide sequences in a genome of a cell.

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】使用向導RNA/CAS內切核酸酶系統改變農學性狀及其使用方法相關專利申請的交叉引用本專利申請要求2014年7月11日提交的美國臨時申請62/023239的優先權，所述臨時申請全文以引用方式并入本文。
本專利技術涉及植物分子生物學領域，具體涉及用于改變植物細胞的基因組的方法。
技術介紹
重組DNA技術已使得可以將外來DNA序列插入生物體的基因組中，從而改變該生物體的表型。最常用的植物轉化方法是農桿菌屬(Agrobacterium)感染和基因槍粒子轟擊，在這些方法中轉基因以隨機方式和以不可預測的拷貝數整合進植物基因組中。因此，人們作出努力來控制植物中的轉基因整合。一種用于插入或者修飾DNA序列的方法涉及通過引入側接有與基因組靶標同源的序列的轉基因DNA序列來進行的同源DNA重組。雖然已開發出了幾種方法來靶向植物基因組中的特定位點以進行修飾，但對用于產生具有改變的基因組的能育植物的更高效和有效的方法仍存在需求，該改變的基因組包含位于該植物基因組的限定區域中的特異性修飾。
技術實現思路
本專利技術提供了在植物中利用向導RNA/CAS內切核酸酶系統的組合物和方法，從而對植物或植物細胞的基因組中的靶序列(涉及改善植物的農學性狀)進行基因組修飾，選擇植物，編輯基因，以及將目的多核苷酸插入植物基因組中。該方法和組合物利用向導RNA/CAS內切核酸酶系統來提供修飾或改變植物、植物細胞或種子的基因組內靶位點和目的核苷酸的有效系統。一旦鑒定基因組靶位點，就可利用多種方法進一步修飾靶位點，由此使得其可包含多種目的多核苷酸。本專利技術還公開了育種方法和用于利用雙組分RNA向導和Cas內切核酸酶系統來選擇植物的方法。本專利技術還提供了具有向導RNA/Cas內切核酸酶系統的核酸構建體、植物、植物細胞、外植體、種子和谷物。本專利技術還提供了利用向導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統的組合物和方法，從而對細胞或生物體的基因組中的靶序列進行基因組修飾，基因編輯，以及將目的多核苷酸插入細胞或生物體的基因組中或使來自于細胞或生物體的基因組的目的多核苷酸缺失。該方法和組合物利用向導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統以提供修飾或改變靶位點和編輯細胞基因組內的目的核苷酸序列的有效系統，其中向導多核苷酸由RNA序列、DNA序列、或DNA-RNA組合序列組成。在一個實施方案中，一種改善植物的農學性狀的方法，該方法包括：提供靶向改善植物的一個或多個農學特性中所涉及的多核苷酸的向導RNA，該向導RNA與在多核苷酸中產生雙鏈斷裂的Cas內切核酸酶相關聯；以及生成植物，其中該植物表現出農學性狀的改善。在一個實施方案中，本專利技術還公開了與對應的內源性未修飾的基因組DNA相比包括一個或多個核苷酸變化的供體多核苷酸。在一個實施方案中，供體多核苷酸不編碼全長蛋白質。在一個實施方案中，供體多核苷酸包含異源調控元件。在一個實施方案中，調控元件包含啟動子。在一個實施方案中，調控元件包含增強子元件。在一個實施方案中，增強子元件來源于植物。在一個實施方案中，多核苷酸選自調控元件、5’-UTR、內含子、外顯子、編碼序列和啟動子。在一個實施方案中，異源調控元件來自于與改善植物的一個或多個農學特性中所涉及的多核苷酸相同的植物物種。在一個實施方案中，向導RNA靶向選自涉及ZmArgos8、ZmACS6、ZmSRTF18、ZmXERICO1、海藻糖-6-磷酸酯磷酸酶(T6PP)和ZmSTPP3的表達的多核苷酸序列的多核苷酸。在一個實施方案中，農學特性選自非生物脅迫耐受性。在一個實施方案中，非生物脅迫耐受性為干旱或缺乏營養物質。在一個實施方案中，農學特性為收率的增大或耐旱性的增加。在一個實施方案中，Cas9內切核酸酶在多核苷酸的編碼區域中產生雙鏈斷裂。在一個實施方案中，植物選自玉米、大豆、稻、小麥、高粱、蕓苔屬、向日葵和亞麻薺。一種改善玉米植物的谷物收率的方法，該方法包括：提供靶向涉及乙烯生物合成或乙烯信號化的多核苷酸的向導RNA，該向導RNA與在該多核苷酸中產生雙鏈斷裂的Cas內切核酸酶相關聯地起作用；以及生成植物，其中玉米植物表現出改善的谷物收率。在一個實施方案中，與涉及乙烯生物合成或乙烯信號化的多核苷酸的對應的內源性未修飾的基因組DNA相比，供體多核苷酸包括一個或多個核苷酸變化。在一個實施方案中，多核苷酸為玉米ACC合酶。在一個實施方案中，多核苷酸為玉米ARGOS。在一個實施方案中，玉米ACC合酶的表達相比于對照玉米植物降低。在一個實施方案中，玉米ARGOS相比于對照玉米植物增加。在一個實施方案中，玉米ARGOS通過插入異源調控元件而增加。一種改善玉米植物的谷物收率或氮利用效率的方法，該方法包括：提供靶向調控編碼絲氨酸蘇氨酸蛋白磷酸酶的多核苷酸的表達的基因組區域的向導RNA，該向導RNA與在該基因組區域中產生雙鏈斷裂的Cas內切核酸酶相關聯地起作用；以及生成玉米植物，其中該玉米植物表現出改善的谷物收率或氮利用效率。在一個實施方案中，絲氨酸蘇氨酸蛋白磷酸酶為ZmSTPP3。在一個實施方案中，ZmSTPP3的表達相比于對照玉米植物增加。在一個實施方案中，ZmSTPP3的表達通過插入異源調控元件來增加。在一個實施方案中，異源調控元件為中等組成型啟動子。在一個實施方案中，異源調控元件來源于玉米。一種改善玉米植物的谷物收率或氮利用效率的方法，該方法包括：提供靶向玉米植物的基因組區域的向導RNA以引入多核苷酸的一個或多個變化，從而生成雄性能育性減少的顯性表型，該向導RNA與在該基因組區域中產生雙鏈斷裂的Cas內切核酸酶相關聯地起作用；以及生成玉米植物，其中當通過包括大量能育花粉的玉米植物受精時，該玉米植物表現出減少的雄性能育性和由此改善的谷物收率或氮利用效率。在一個實施方案中，雄性能育性減少。在一個實施方案中，玉米植物是良種近交或雜交玉米植物。在一個實施方案中，MS44多肽在對應于信號肽裂解位點的位置處具有突變。在一個實施方案中，信號肽裂解位點位于未加工的MS44多肽的約38位氨基酸或39位氨基酸。一種改善作物植物的谷物收率或氮利用效率的方法，該方法包括：提供靶向植物的基因組區域的向導RNA以引入編碼與SEQIDNO：554具有至少70％同一性的多肽的多核苷酸的一個或多個變化，從而生成雄性能育性減少的顯性表型，該向導RNA與在該基因組區域中產生雙鏈斷裂的Cas內切核酸酶相關聯地起作用；以及生成植物，其中當通過包括大量能育花粉的能育植物受精時，該植物表現出減少的雄性能育性和由此改善的谷物收率或氮利用效率。在一個實施方案中，植物選自稻、小麥和高粱。在一個實施方案中，植物是能夠轉化的良種品種。在一個實施方案中，MS44多肽在對應于信號肽裂解位點的位置處具有突變。在一個實施方案中，植物在氮減少的環境中生長。在一個實施方案中，該多肽與SEQIDNO：554具有約90％的同一性。在本公開的一個實施方案中，該方法包括用于選擇在其植物基因組中包含改變的靶位點的植物的方法，該方法包括：a)獲得第一植物，該第一植物包含至少一種能夠在植物基因組的靶位點處引入雙鏈斷裂的Cas內切核酸酶；b)獲得第二植物，該第二植物包含能夠與(a)的Cas內切核酸酶形成復合物的向導RNA，c)使(a)的第一植物與(b)的第二植物雜交；d)評估(c)的子代本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種改善植物的農學性狀的方法，所述方法包括：提供向導RNA，所述向導RNA靶向改善植物的一個或多個農學特性中所涉及的多核苷酸，所述向導RNA與在所述多核苷酸中產生雙鏈斷裂的Cas內切核酸酶相關聯；以及生成所述植物，其中所述植物表現出農學性狀的改善。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2014.07.11 US 62/0232391.一種改善植物的農學性狀的方法，所述方法包括：提供向導RNA，所述向導RNA靶向改善植物的一個或多個農學特性中所涉及的多核苷酸，所述向導RNA與在所述多核苷酸中產生雙鏈斷裂的Cas內切核酸酶相關聯；以及生成所述植物，其中所述植物表現出農學性狀的改善。2.根據權利要求1所述的方法，所述方法還包括與對應的內源性未修飾的基因組DNA相比包括一個或多個核苷酸變化的供體多核苷酸。3.根據權利要求2所述的方法，其中所述供體多核苷酸不編碼全長蛋白質。4.根據權利要求2所述的方法，其中所述供體多核苷酸包含異源調控元件。5.根據權利要求4所述的方法，其中所述調控元件包含啟動子。6.根據權利要求4所述的方法，其中所述調控元件包含增強子元件。7.根據權利要求6所述的方法，其中所述增強子元件來源于植物。8.根據權利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸選自調控元件、5’-UTR、內含子、外顯子、編碼序列和啟動子。9.根據權利要求4所述的方法，其中所述異源調控元件來自于與改善所述植物的一個或多個農學特性中所涉及的多核苷酸相同的植物物種。10.根據權利要求1所述的方法，其中所述向導RNA靶向選自涉及ZmArgos8、ZmACS6、ZmSRTF18、ZmXERICO1、海藻糖-6-磷酸酯磷酸酶(T6PP)和ZmSTPP3的表達的多核苷酸序列的多核苷酸。11.根據權利要求1所述的方法，其中所述農學特性選自非生物脅迫耐受性。12.根據權利要求11所述的方法，其中所述非生物脅迫耐受性為干旱或缺乏營養物質。13.根據權利要求1所述的方法，其中所述農學特性為收率的增大或耐旱性的增加。14.根據權利要求1所述的方法，其中Cas9內切核酸酶在所述多核苷酸的編碼區域中產生雙鏈斷裂。15.根據權利要求1所述的方法，其中所述植物選自玉米、大豆、稻、小麥、高粱、蕓苔屬、向日葵和亞麻薺。16.一種改善玉米植物的谷物收率的方法，所述方法包括：提供向導RNA，所述向導RNA靶向涉及乙烯生物合成或乙烯信號化的多核苷酸，所述向導RNA與在所述多核苷酸中產生雙鏈斷裂的Cas內切核酸酶相關聯地起作用；以及生成所述植物，其中所述玉米植物表現出改善的谷物收率。17.根據權利要求16所述的方法，所述方法還包括與涉及乙烯生物合成或乙烯信號化的所述多核苷酸的對應的內源性未修飾的基因組DNA相比，包括一個或多個核苷酸變化的供體多核苷酸。18.根據權利要求16所述的方法，其中所述多核苷酸為玉米ACC合酶。19.根據權利要求16所述的方法，其中所述多核苷酸為玉米ARGOS。20.根據權利要求18所述的方法，其中所述玉米ACC合酶的表達相比于對照玉米植物降低。21.根據權利要求19所述的方法，其中所述玉米ARGOS的表達相比于對照玉米植物增加。22.根據權利要求21所述的方法，其中所述玉米ARGOS的表達通過插入異源調控元件來增加。23.根據權利要求22所述的方法，其中所述異源調控元件為中等組成型啟動子。24.根據權利要求22所述的方法，其中所述異源調控元件來源于玉米。25.一種改善玉米植物的谷物收率或氮利用效率的方法，所述方法包括：提供向導RNA，所述向導RNA靶向調控編碼絲氨酸蘇氨酸蛋白磷酸酶的多核苷酸的表達的基因組區域，所述向導RNA與在所述基因組區域中產生雙鏈斷裂的Cas內切核酸酶相關聯地起作用；以及生成所述玉米植物，其中所述玉米植物表現出改善的谷物收率或氮利用效率。26.根據權利要求25所述的方法，其中所述絲氨酸蘇氨酸蛋白磷酸酶為ZmSTPP3。27.根據權利要求26所述的方法，其中所述ZmSTPP3的表達相比于對照玉米植物增加。28.根據權利要求26所述的方法，其中所述ZmSTPP3的表達通過插入異源調控元件來增加。29.根據權利要求28所述的方法，其中所述異源調控元件為中等組成型啟動子。30.根據權利要求28所述的方法，其中所述異源調控元件來源于玉米。31.一種改善玉米植物的谷物收率或氮利用效率的方法，所述方法包括：提供靶向所述玉米植物的基因組區域的向導RNA以引入多核苷酸的一個或多個變化，從而生成雄性能育性減少的顯性表型，所述向導RNA與在所述基因組區域中產生雙鏈斷裂的Cas內切核酸酶相關聯地起作用；以及生成所述玉米植物，其中當通過包括大量能育花粉的玉米植物受精時，所述玉米植物表現出減少的雄性能育性和由此改善的谷...

【專利技術屬性】
技術研發人員：史金瑞，郜會榮，牛小牧，
申請(專利權)人：先鋒國際良種公司，
類型：發明
國別省市：美國,US