具有廣譜活性的殺昆蟲多肽及其用途制造技術

本公開提供了從蘇云金芽孢桿菌菌株獲得的編碼具有對昆蟲害蟲(包括鱗翅目和鞘翅目昆蟲)的殺蟲活性的多肽的核酸及其變體和片段。本公開的具體實施方案提供編碼殺蟲蛋白的分離核酸、包含本發(fā)明專利技術實施方案的核酸的殺蟲組合物、DNA構建體及轉化的微生物和植物。這些組合物可在防治害蟲特別是植物害蟲的方法中使用。

Insect killing polypeptide having broad spectrum activity and use thereof

The present disclosure provides nucleic acids obtained from Bacillus thuringiensis strains that encode polypeptides having insecticidal activity against insect pests (including Lepidoptera and Coleoptera insects), and variants and fragments thereof. A specific embodiment of the present disclosure provides a nucleic acid encoding a pesticidal protein, an insecticidal composition containing the nucleic acid of the present embodiment of the invention, a DNA construct, and a transformed microorganism and plant. These compositions may be used in the prevention and control of pests, especially plant pests.

【技術實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術】具有廣譜活性的殺昆蟲多肽及其用途對以電子方式提交的序列表的引用創(chuàng)建于2015年9月24日、大小為59千字節(jié)的文件名為“5383WOPCT_SequenceListing.txt”的序列表以計算機可讀形式與本說明書同時提交。該序列表是本說明書的一部分，并且全文以引用方式并入本文。
本公開涉及從新型蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)基因獲得的天然和重組核酸，該新型蘇云金芽孢桿菌基因編碼以針對昆蟲害蟲的殺蟲活性為特征的殺蟲多肽。本公開的組合物和方法利用所公開的核酸及其編碼的殺蟲多肽來防治植物害蟲。
技術介紹
昆蟲害蟲是造成全世界農作物損失的主要因素。例如，行軍蟲取食、黑地蠶損害或者歐洲玉米螟損害可對農業(yè)生產商造成經濟上的破壞。單單是歐洲玉米螟侵襲非甜質玉米和甜玉米造成的昆蟲害蟲相關作物損失，一年的損害和防治費用就達大約十億美元。傳統(tǒng)上，影響昆蟲害蟲群體的主要方法是施用廣譜化學殺昆蟲劑。但是，消費者和政府監(jiān)管者都日益關注與合成化學殺蟲劑的生產和使用相關的環(huán)境危害。由于這些關注，監(jiān)管者已經禁止或限制一些危害比較大的殺蟲劑的使用。因此，人們對于開發(fā)另類殺蟲劑有很大的興趣。使用微生物劑如真菌、細菌或者另一種昆蟲對具有農業(yè)意義的昆蟲害蟲進行生物防治，可提供具有環(huán)境友好性和商業(yè)吸引力的合成化學殺蟲劑替代方案。一般而言，生物殺蟲劑的使用造成的污染和環(huán)境危害的風險較低，并且生物殺蟲劑能提供比傳統(tǒng)廣譜化學殺昆蟲劑的特征性的靶標特異性更高的靶標特異性。另外，生物殺蟲劑的生產成本往往較低，因此提高了眾多作物的經濟產量。已知芽孢桿菌屬(Bacillus)微生物的某些物種對于多種昆蟲害蟲具有殺蟲活性，這些昆蟲害蟲包括鱗翅目(Lepidoptera)、雙翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、半翅目(Hemiptera)等等。蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)(Bt)和日本金龜芽孢桿菌(Bacilluspapilliae)是至今為止發(fā)現(xiàn)的最成功的生物防治劑的代表。幼蟲芽孢桿菌(B.larvae)、緩病芽孢桿菌(B.lentimorbus)、球形芽孢桿菌(B.sphaericus)的菌株(Harwook編輯，(1989)，Bacillus(普萊南出版社(PlenumPress))，306)和蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)的菌株(WO96/10083)也被指出具有昆蟲病原性。殺蟲活性看起來集中在伴胞晶體蛋白包涵體中，但從芽孢桿菌的營養(yǎng)生長期也分離到殺蟲蛋白。有數(shù)種編碼這些殺蟲蛋白的基因已得到分離和表征(參見例如美國專利5,366,892和5,840,868)。微生物殺昆蟲劑特別是那些從芽孢桿菌(Bacillus)菌株獲得的微生物殺昆蟲劑，在農業(yè)上作為害蟲化學防治的替代方案已起到重要的作用。最近，農業(yè)科學家通過對作物進行遺傳工程改造以產生來自芽孢桿菌的殺蟲蛋白，開發(fā)出了抗蟲性增強的作物。例如，已對玉米和棉花作物進行遺傳工程改造以產生從Bt的菌株分離的殺蟲蛋白(參見例如Aronson(2002)CellMol.LifeSci.59(3)：417-425；Schnepf等人(1998)MicrobiolMolBiolRev.62(3)：775-806)。這些經遺傳工程改造的作物目前在美國農業(yè)中廣泛應用，給農場主提供了替代傳統(tǒng)昆蟲防治方法的環(huán)境友好的方案。另外，經遺傳工程改造而含有殺蟲Cry毒素的馬鈴薯已被出售給美國農場主。雖然這些經遺傳工程改造的抗昆蟲作物已證明在商業(yè)上十分成功，但它們僅對較窄范圍的經濟上重要的昆蟲害蟲具有抗性。因此，仍然需要對昆蟲害蟲具有更大范圍的殺昆蟲活性的新Bt毒素，例如對更多種類的鱗翅目昆蟲具有活性的毒素。另外，仍然需要對多種昆蟲害蟲具有活性的生物殺蟲劑和需要具有改善的殺昆蟲活性的生物殺蟲劑。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術提供用于影響昆蟲害蟲的組合物和方法。更具體而言，本公開的實施方案涉及利用編碼殺昆蟲肽的核苷酸序列來產生能表達實施方案的殺昆蟲多肽的轉化微生物和植物從而影響昆蟲的方法。在一些實施方案中，所述核苷酸序列編碼對至少一種屬于鱗翅目的昆蟲具有殺蟲作用的多肽。本專利技術實施方案提供編碼對昆蟲害蟲具有殺蟲活性的多肽的核酸分子及其片段和變體(例如SEQIDNO：1、SEQIDNO：3、SEQIDNO：5，并且分別編碼SEQIDNO：2、SEQIDNO：4、SEQIDNO：6和SEQIDNO：8的多肽)。獲自Bt的本專利技術實施方案的野生型(例如天然)核苷酸序列編碼殺昆蟲肽。本專利技術實施方案還提供所公開的核苷酸序列的編碼生物活性(例如殺昆蟲)多肽的片段和變體。本專利技術實施方案還提供由本專利技術實施方案的天然或經修飾的(例如經誘變或經操縱的)核酸所編碼的分離的殺蟲(例如殺昆蟲)多肽。具體舉例，本專利技術實施方案的殺蟲蛋白包括從經誘變的核酸產生的全長蛋白質和多肽的片段，所述經誘變的核酸被設計用來將特定氨基酸序列引入到本專利技術實施方案的多肽中。在特定實施方案中，所述多肽相對于衍生它們的天然多肽的殺蟲活性具有增強的殺蟲活性。本專利技術實施方案的核酸也可用于產生轉基因的(例如轉化的)單子葉植物或雙子葉植物，所述植物的特征在于其基因組包含至少一個被穩(wěn)定摻入的核苷酸構建體，所述核苷酸構建體包含可操作地連接至驅動所編碼的殺蟲多肽表達的啟動子的本專利技術實施方案的編碼序列。因此，本專利技術還提供轉化的植物細胞、植物組織、植物及其種子。在一個特定實施方案中，可使用已被優(yōu)化以使在宿主植物中的表達提高的核酸來產生轉化植物。例如，可將本專利技術實施方案的殺蟲多肽之一進行反翻譯，以產生包含為了在特定宿主中表達而優(yōu)化的密碼子的核酸，所述宿主例如是作物如玉米(玉蜀黍)作物。這種轉化的植物(例如雙子葉植物或者單子葉植物)表達編碼序列將導致產生殺蟲多肽并給植物賦予提高的抗蟲性。一些實施方案提供表達能在用于影響各種昆蟲害蟲的方法中使用的殺蟲多肽的轉基因植物。本專利技術實施方案還包括含有本專利技術實施方案的殺昆蟲多肽的殺蟲或殺昆蟲組合物，并可任選包含另外的殺昆蟲肽。本專利技術實施方案涵蓋將這種組合物應用于昆蟲害蟲的環(huán)境以影響昆蟲害蟲。附圖說明圖1A-1D示出了Cry1JPD166多肽(SEQIDNO：2)、Cry1JP578V多肽(SEQIDNO：4)、Cry1JPS1多肽(SEQIDNO：6)和Cry1JPS1P578V(SEQIDNO：8)的序列比對。氨基酸差異用陰影表示。第578位脯氨酸向纈氨酸的氨基酸置換由氨基酸位置上方的“◆”指示。對編碼Cry1JPS1(SEQIDNO：6)和Cry1JPS1P578V(SEQIDNO：8)的大豆表達基因優(yōu)化引起的第115、594和794位氨基酸置換由氨基酸位置上方的“●”指示。具體實施方式本公開的實施方案涉及用于影響昆蟲害蟲尤其是植物害蟲的組合物和方法。更具體而言，本專利技術實施方案的分離核酸及其片段和變體包含編碼殺蟲多肽(例如蛋白質)的核苷酸序列。所公開的殺蟲蛋白對昆蟲害蟲具有生物活性(例如殺蟲活性)，所述昆蟲害蟲例如但不限于鱗翅目的昆蟲害蟲。本專利技術實施方案的組合物包含編碼殺蟲多肽的分離核酸及其片段和變體、包含本專利技術實施方案的核苷酸序列的表達盒、分離的殺蟲蛋白以及殺蟲組合物。一些實施方案提供對鱗本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
一種變體Cry1J多肽，其包含在對應于SEQ?ID?NO：2的第578位的殘基處具有纈氨酸置換的氨基酸序列，其中所述變體Cry1J多肽相比于SEQ?ID?NO：2的Cry1J多肽對蛋白水解降解的穩(wěn)定性增強。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2014.10.15 US 62/0642701.一種變體Cry1J多肽，其包含在對應于SEQIDNO：2的第578位的殘基處具有纈氨酸置換的氨基酸序列，其中所述變體Cry1J多肽相比于SEQIDNO：2的Cry1J多肽對蛋白水解降解的穩(wěn)定性增強。2.根據(jù)權利要求1所述的變體Cry1J多肽，其中所述增強的穩(wěn)定性在模擬胃液(SGF)測定中測量。3.根據(jù)權利要求1所述的變體Cry1J多肽，其中所述變體Cry1J多肽與SEQIDNO：2具有至少95％的同一性。4.根據(jù)權利要求1所述的變體Cry1J多肽，其中所述變體Cry1J多肽與SEQIDNO：4或SEQIDNO：8具有至少95％的同一性。5.根據(jù)權利要求1、2、3或4所述的變體Cry1J多肽，其中所述變體Cry1J多肽包含選自SEQIDNO：4和SEQIDNO：8的氨基酸序列。6.一種重組核酸分子，其編碼根據(jù)權利要求1、2、3、4或5所述的變體Cry1J多肽。7.根據(jù)權利要求6所述的重組核酸分子，其中所述核酸序列已被優(yōu)化以在植物中表達。8.根據(jù)權利要求7所述的重組核酸分子，其中所述核酸序列是已被設計用來在植物中表達的具有植物優(yōu)選的密碼子的合成核苷酸序列。9.根據(jù)權利要求6、7或8所述的重組核酸分子，其中所述核酸序列已被優(yōu)化以在大豆中表達。10.根據(jù)權利要求6所述的重組核酸分子，其中所述核酸選自SEQIDNO：3和SEQIDNO：7。11.一種DNA構建體，其包含根據(jù)權利要求6至10中任一項所述的核酸分子和可操作地連接至所述核酸分子的異源調控元件。12.一種宿主細胞，其包含根據(jù)權利要求11所述的DNA構...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：A阿巴德，H董，J里塞，X施，
申請(專利權)人：先鋒國際良種公司，納幕爾杜邦公司，
類型：發(fā)明
國別省市：美國,US