溶瘤病毒制造技術

本發明專利技術涉及用于癌癥治療的溶瘤痘苗病毒和病毒載體，其中該病毒包括位置取向相同的至少三個痘苗病毒啟動子。

Oncolytic virus

The invention relates to an oncolytic vaccinia virus and viral vectors for cancer therapy, the virus including at least three position of the same promoter of vaccinia virus.

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】溶瘤病毒
本專利技術涉及癌癥治療。特別地，本專利技術涉及用于癌癥治療的溶瘤性痘苗病毒和病毒載體。
技術介紹
盡管微創手術、超分割放療和化療藥物新組合方面取得了進展，但是許多類型的實體瘤患者的存活率仍保持不變。溶瘤病毒是治療對常規治療有抗性的癌癥的一種有吸引力的治療劑。溶瘤病毒是能夠特異性靶向并殺死癌細胞的病毒。此外，溶瘤病毒還可以提供提高宿主自身抗癌反應所必需的免疫刺激信號。痘苗病毒是雙鏈DNA病毒，其具有許多使其具有溶瘤治療吸引力的候選項的特征。其能夠快速復制，有效擴散到腫瘤以及強溶解能力。此外，痘苗已經得到廣泛研究，并且具有被清楚理解的分子生物學，具有高克隆能力和多種商業可用的天然和合成啟動子，使其成為攜帶異源核酸序列的載體的理想選擇。痘苗具有良好的安全性，并且容易獲得對不受控制的感染的治療。此外，通常在實體瘤中發現的缺氧微環境，不利于許多類型的溶瘤病毒的復制和發揮功效，但不會對痘苗病毒的復制和功效不利。已報道了溶瘤痘苗病毒的幾種菌株，例如WesternReserve，Wyeth和Lister菌株。已經創建了每一種所述菌株的各種缺失突變體。McCart等人(CancerRes.2001,61；8751-8757)描述了一種在胸苷激酶(TK)基因和病毒生長因子(VGF)基因中具有缺失的WesternReserve(WR)株。這些缺失突變體能夠有效地交叉觸發針對腫瘤抗原的免疫系統。然而，生物分布研究表明，其在正常卵巢組織中具有顯著病毒滴度而在骨髓中則較小，提高了痘苗病毒治療后發生不育和骨髓抑制的預期。Hung等人(GeneTherapy,2007,14；20–29)描述了一種TK缺陷型痘苗Lister菌株。然而，觀察到該菌株還在卵巢腫瘤之外的正常卵巢中定位。將異源基因例如細胞因子編碼基因插入病毒中，可以進一步驅動免疫應答。然而，細胞因子的插入可以通過早期病毒清除來降低病毒復制功效。這確實已用”武裝”有一些免疫調節基因如IL-2，IL-15，TNF和CD40配體的痘苗病毒在體內觀察到。盡管溶瘤病毒領域已經取得了進展，但是市場上尚無基于痘苗的治療產品。因此，需要更有效的溶瘤性痘苗來治療癌癥。
技術實現思路
本專利技術提供改進的溶瘤性痘苗病毒。本申請的專利技術人驚奇地發現，在腫瘤組織中，具有失活的N1L基因的TK缺陷型痘苗病毒株顯示出比現有技術更強的選擇性和抗腫瘤功效。本專利技術還提供了痘苗病毒載體。具體實施方式本專利技術的第一方面提供了包含至少三種痘苗病毒啟動子的核酸序列，其中所述至少三種啟動子以相同取向位于核酸序列中。線性DNA具有兩種可能取向：5'至3'方向和3'至5'方向。例如，如果一個啟動子位于5'至3'方向，并且如果第二啟動子也位于相同多核苷酸分子/鏈內的5'至3'方向，則兩個啟動子的位置具有相同取向。核酸序列可以是天然的、合成的或重組的。它可以是例如cDNA、PCR產物或基因組序列。其可以是分離的，或作為質粒、載體或宿主細胞的一部分。質粒是具有獨立于染色體DNA復制的能力的環狀染色體外DNA分子。質粒可用于將表達盒導入宿主細胞。質粒也可以用于在宿主細胞中表達多肽。例如，可以用能夠編碼特定多肽的質粒轉染細菌宿主細胞，以便表達該多肽。該術語還包括能夠容納DNA更長部分的酵母人工染色體和細菌人工染色體。啟動子是具有可啟動特定基因轉錄的特異性序列的DNA區域。用于在痘苗中表達異源基因的啟動子，包括控制早期和晚期轉錄活性的啟動子，例如mH5、H5、P7.5和PE/L。本申請所述的異源基因，是病毒中通常不存在的基因。修飾的H5啟動子(mH5)主要具有早期活性，且具有比天然存在的H5更高的穩定性。優選地，所述至少三個啟動子是mH5。在本專利技術的優選實施例中，啟動子包含與圖1所示序列基本上同源的核苷酸序列。具有大于20％一致性(例如25％，30％，40％，50％60％，70％，80％，90％，95％或99％)則認為是同源序列。如本申請所述，基本上同源是指表現出至少60％或70％，優選至少80％，更優選至少90％，最優選至少95％，96％，97％，98％，99％％或更高的一致性。在本專利技術的一個實施例中，所述序列與如圖1中所示的序列集具有至少80％或更高(例如，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％等)的一致性。如本申請所使用的術語同源性和一致性是可互換的。用于確定同源性的序列比較，可以使用容易獲得的序列比較軟件來進行。示例包括但不限于BLAST(參見Ausubeletal.,1999ShortProtocolsinMolecularBiology,4thEd-第18章)和FASTA((Altschuletal.,1990J.Mol.Biol.403-410)。BLAST和FASTA都可用于離線和在線搜索(參見Ausubeletal.,1999,ShortProtocolsinMolecularBiology，第7-58至7-60頁)。在第一方面的一個實施例中，核酸序列存在于載體中。如本申請所述的載體是指，用于將核酸序列引入細胞或病毒中以進行表達或復制的構建體。其是指重組構建體，例如質粒、病毒或能夠在引入細胞或病毒后表達或復制核酸序列的任何其它構建體。第一方面的核酸序列可以是表達盒的一部分。表達盒是載體的一部分。其包含啟動子、開放閱讀框和3'非翻譯區。在本專利技術的一個實施例中，痘苗病毒載體包含與圖2所示序列具有至少80％或更高(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等)同源性的核苷酸序列。在本專利技術的另一個實施例中，核酸序列編碼異源多肽。本申請所述的多肽，是指通過肽鍵連接在一起的多個氨基酸殘基。其可與蛋白質、肽、寡肽互換使用，并且包括糖蛋白及其衍生物。術語“多肽”還旨在涵蓋保有與原始多肽相同生物學功能或活性的多肽類似物和衍生物。如本申請所述的異源多肽是指，通常不由天然病毒表達的任何多肽。異源多肽可以是生物活性的。如本申請所述的生物活性多肽，是指具有生物學功能或活性的多肽。在本專利技術的一個實施例中，生物活性多肽是治療性的。治療性多肽是已經或正在開發的用于治療用途的多肽。治療性多肽的示例包括但不限于細胞因子，趨化因子和生長因子。細胞因子可以是免疫調節劑，例如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35和IL-36)、干擾素(INF-α、INF-β、INF-γ和INF-ω)、腫瘤壞死因子(TNF)和/或粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)。在本專利技術的一個實施例中，多肽是白細胞介素。在本專利技術的優選實施例中，多肽是IL-12。IL-12可以來自任何動物，例如人(hIL-12)、小鼠(mIL-12)、馬、牛、豬等。它可以是天然的或重組的。優選地，編碼IL-12的核苷酸序列是全長IL-12基因。在其它實施例中，核苷酸序列編本文檔來自技高網...

【技術保護點】
包含至少三個痘苗病毒啟動子的核酸序列，其中所述至少三個啟動子的位置具有相同取向。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2014.04.01 GB 1405834.11.包含至少三個痘苗病毒啟動子的核酸序列，其中所述至少三個啟動子的位置具有相同取向。2.根據權利要求1所述的核酸序列，其特征在于，所述啟動子是在所述病毒生命周期的早期和/或晚期具有活性的啟動子。3.根據權利要求2所述的核酸序列，其特征在于，所述啟動子選自mH5、H5、P7.5和PE/L。4.根據權利要求1所述的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列編碼異源性多肽。5.根據權利要求4所述的核酸序列，其特征在于，所述多肽為細胞因子。6.根據權利要求5所述的核酸序列，其特征在于，所述細胞因子選自GM-CSF、IL-12和IL-21。7.根據權利要求1至6中任一項所述的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列包含一個或多個限制性位點。8.根據權利要求7所述的核酸序列，其特征在于，所述一個或多個限制性位點選自SalI、BglII、HindIII、SmaI、BamHI和MluI。9.根據權利要求4所述的核酸序列，其特征在于，所述多肽為報告子多肽。10.根據權利要求1至9中任一項所述的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列包括與如圖1所示的核酸序列基本同源的序列。11.包含根據權利要求1至10中任一項所述的核酸序列的痘苗病毒載體。12.包含根據權利要求1至11中任一項所述的載體或核酸序列的痘苗病毒，其中所述載體或核酸序列插入到N1L基因內。13.包含失活N1L基因的TK缺乏型痘苗病毒。14.根據權利要求13所述的TK缺乏型痘苗病毒，其特征在于，通過插...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王堯河，袁明，賈漢吉爾·艾哈邁德，尼古拉斯·羅伯特·勒莫因，
申請(專利權)人：瑪麗女王倫敦大學，
類型：發明
國別省市：英國,GB