病毒載體制造制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及經(jīng)修飾的哺乳動物細胞，其中該細胞的基因組被修飾以包含在啟動子的控制下表達CP77的序列，使得經(jīng)修飾的細胞系維持在未經(jīng)修飾的細胞中較不能繁殖或不能繁殖的痘病毒的繁殖。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】相關(guān)申請本申請與2013年11月1日提交的澳大利亞專利申請?zhí)?013904242和2014年2月7日提交的澳大利亞專利申請?zhí)?014900370相關(guān)并且要求其優(yōu)先權(quán)，這些申請的每一個的完整內(nèi)容通過引用并入本文。專利
本專利技術(shù)涉及適于繁殖并因此適于制造基于痘病毒的藥物的細胞和細胞系的開發(fā)。特別地，本說明書涉及，為了用于繁殖這樣的痘病毒以用于制造治療劑或預(yù)防劑的重組的經(jīng)修飾的細胞基底。背景本說明書的參考文獻的著錄細節(jié)在說明書的末尾列出。在本說明書中對任何在先出版物(或來自它的信息)或者任何已知的事物的參考不能且不應(yīng)認為是承認或認可或者以任何形式暗示，該在先出版物(或來自它的信息)或者已知事物形成本說明書所屬
中的公知常識的一部分。本說明書中提及的所有出版物通過引用以其整體并入本文。痘病毒家族包括2個亞家族，脊索動物痘病毒亞科(Chordopoxvirinae)和昆蟲痘病毒亞科(Entomopoxvirinae)。脊索動物痘病毒亞科包括8個屬，包括包含感染人的種(例如，天花病毒(variola virus)、天花的致病因子、牛痘病毒(cowpox virus)(其形成詹納在1796年報道的原始天花疫苗)、痘苗病毒(vaccinia virus)(被用作第二代天花疫苗)和猴痘病毒(monkeypox virus))的正痘病毒屬(Orthopoxviridae)、和包含感染鳥的種的禽痘病毒屬(Avipoxviridae)病毒，諸如雞痘病毒(fowlpox virus)和金絲雀痘病毒(canarypox virus)。除了它們作為抗原在天花疫苗中的用途，對重組的基于痘苗病毒的病毒和禽痘病毒作為“骨架”載體的用途存在很大興趣。作為細胞質(zhì)內(nèi)載體，正痘病毒屬能夠，除其他以外，遞送外源抗原至宿主細胞質(zhì)和將抗原加工成用于在細胞表面呈現(xiàn)的肽的抗原加工通路。這樣的表達外源抗原的載體在針對疾病諸如AIDS、結(jié)核病、瘧疾和癌癥的疫苗的開發(fā)中使用，所述疾病已被證明難以用其他疫苗接種策略治療。正痘病毒屬具有大小范圍從副痘病毒的130kb至禽痘病毒(avipoxvirus)的超過300kb的線性雙鏈DNA基因組，并且其在宿主中的生命周期完全在宿主細胞質(zhì)中度過。痘病毒大體上獨立于其宿主細胞和宿主細胞分子工作，特別是對于參與早期mRNA合成的過程。但是，宿主分子表現(xiàn)為被用于中間和晚期病毒轉(zhuǎn)錄的起始或終止。痘病毒產(chǎn)生結(jié)構(gòu)多樣的“宿主范圍因子(host range factor)”，其特異性地靶向并操控宿主信號通路以準許允許病毒復(fù)制的細胞條件。多數(shù)痘病毒可以結(jié)合并感染哺乳動物細胞，但繼發(fā)感染是允許的(能夠產(chǎn)生感染性的病毒粒)或非-允許的(大體上不能產(chǎn)生感染性的病毒粒)取決于參與的具體痘病毒和具體的細胞類型。目前，對分子水平的痘病毒-宿主相互作用存在相對少的了解，特別是宿主-范圍基因，以及哪些因子是調(diào)節(jié)關(guān)系以有利于病毒和細胞繁殖二者必要的。對于宿主范圍基因參考文獻的綜述，可以參考全文并入本文的Werden等人,2008。有關(guān)痘苗病毒毒株關(guān)于其作為天花病毒疫苗和隨后作為病毒載體的觀察，已經(jīng)從1960年代早期發(fā)表至今。痘苗病毒的某些毒株，包括用作天花疫苗的毒株，能夠在人細胞中繁殖并因此造成健康風險，諸如病毒性腦炎的發(fā)展。為了開發(fā)更安全的疫苗，來自安卡拉的痘苗病毒毒株(被稱為“CVA”)在非-人細胞中傳代超過500次。在此過程中痘苗病毒基因組改變，大體上包括與原始CVA基因組相比的至少6個主要缺失的發(fā)生。經(jīng)修飾的病毒在人中致病性更低，但仍能夠產(chǎn)生保護性免疫應(yīng)答。此減毒的痘苗病毒被稱為MVA(經(jīng)修飾的痘苗病毒安卡拉)并且還由傳代次數(shù)分類，因為發(fā)現(xiàn)具有不同傳代次數(shù)的病毒在遺傳上和表型上不同。但是，傳代次數(shù)515MVA515被認為是遺傳穩(wěn)定的。在1990年代早期觀察到，MVA毒株，諸如MVA572及其衍生物MVA F6，能夠在非-允許細胞(其中病毒將不繁殖)中以高水平表達痘苗病毒蛋白和異源(重組的)蛋白，使得能夠開發(fā)MVA作為感興趣的異源分子的載體，所述感興趣的異源分子諸如編碼用于疫苗或療法遞送的抗原的那些。最近，已經(jīng)嘗試通過向CVA引入MVA的6個大的、已知的缺失來生產(chǎn)具有MVA性質(zhì)的經(jīng)修飾的痘苗病毒。有趣的是，這不產(chǎn)生具有減弱的MVA性質(zhì)的病毒。有人提出，宿主范圍基因的缺乏可能對觀察的減毒負責，但是，這還未被證實(參見，例如Meyer等人,Journal of General Virology(1991)72:1031-1038)。痘病毒組成特征在于大的、線性dsDNA基因組、用于繁殖的細胞質(zhì)位點和復(fù)雜的病毒粒形態(tài)學的病毒的大家族。痘苗病毒是此組病毒的代表性病毒并且是關(guān)于病毒形態(tài)發(fā)生研究的最多的病毒。痘苗病毒病毒粒以“磚形”或以“卵形”與膜結(jié)合的顆粒出現(xiàn)，具有復(fù)雜的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，該內(nèi)部結(jié)構(gòu)以兩側(cè)具有“側(cè)體(lateral bodies)”的、被圍住的、兩頭凹陷的核心為特征。病毒粒裝配通路包括包含新月形的膜的制造，該膜發(fā)展成不成熟的病毒粒(IV)，并且隨后演化成成熟病毒粒(MV)。超過70種特定的基因產(chǎn)物被包含于痘苗病毒病毒粒內(nèi)，其中已經(jīng)描述了超過50種特定的基因中的突變對痘苗病毒裝配的影響。痘苗病毒通過其表面膜與宿主細胞的細胞質(zhì)膜的融合進入細胞，釋放核心(和側(cè)體)到細胞質(zhì)并激活病毒的轉(zhuǎn)錄程序。病毒粒核心包含早期mRNA合成和修飾所需的全部病毒-編碼酶。早期基因編碼DNA增殖所需的基因，并且因此，隨著早期基因表達達到峰值，病毒DNA增殖接著在被稱為“工廠”的細胞質(zhì)位點發(fā)生。早期基因還編碼中間轉(zhuǎn)錄因子，并且中間基因反過來編碼晚期轉(zhuǎn)錄因子，這樣中間基因和晚期基因在病毒DNA增殖的前提條件的起始后連續(xù)表達。因此，全部病毒基因以時間串聯(lián)轉(zhuǎn)錄，早期、中間和晚期類通過類別-特異性轉(zhuǎn)錄啟動子和病毒編碼的轉(zhuǎn)錄因子區(qū)分。此外，只有增殖的基因組是用于中間和晚期轉(zhuǎn)錄的合格的模板。這兩類基因一起編碼病毒粒結(jié)構(gòu)蛋白、病毒粒酶和裝配因子，并且是裝配新的后代病毒顆粒所需的。病毒攝入和早期表達后不久，在細胞內(nèi)形成感染-特異性細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域的密度一致并且有時被大小隨著時間增加的來自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)的潴泡包圍。這些結(jié)構(gòu)域代表病毒DNA增殖的位點并且經(jīng)常被稱為“病毒工廠”。病毒裝配在病毒工廠內(nèi)隨著剛性的新月形結(jié)構(gòu)(三維的杯形器)的形成開始。在高分辨電子顯微鏡下，這些新月形結(jié)構(gòu)的外層由規(guī)則隔開的被稱為“針(spicule)”的突出物組成。新月表面上沿長度生長而保持相同的曲度，直到它們成為被稱為不成熟的病毒粒(IV)的閉合的圓(三維的球)。IV被密度一致但具有比周圍工廠可辨別的更大的電子密度的“病毒原質(zhì)體”材料充滿。隨著IV的形成，還發(fā)生衣殼化的DNA的攝入：這些在電子顯微照片中作為在IV內(nèi)的電子密集、圓形或卵形亞結(jié)構(gòu)域觀察到，被稱為“擬核”。包含濃縮的DNA的擬核的IV經(jīng)常被稱為“IVN”。IVN向成熟病毒粒(MV)的形態(tài)發(fā)生要求數(shù)個病毒粒蛋白前體通過蛋白水解裂解的成熟。大多數(shù)成熟病毒粒在工廠外被發(fā)現(xiàn)并可以以簇存在于工廠周圍或以從最近的工廠的顯著距離明顯地分開。痘病毒病毒粒以3種感染性形式存在：成熟病毒粒(MV)、包裹病毒粒(WV)和細胞外病毒粒(EV)。MV，病毒的最簡本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種經(jīng)修飾的哺乳動物細胞，其中所述細胞的基因組被修飾以包含在啟動子的控制下編碼CP77的序列，使得所述經(jīng)修飾的細胞系維持在未經(jīng)修飾的細胞中較不能繁殖或不能繁殖的痘病毒的繁殖。

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】2013.11.01 AU 2013904242;2014.02.07 AU 20149003701.一種經(jīng)修飾的哺乳動物細胞，其中所述細胞的基因組被修飾以包含在啟動子的控制下編碼CP77的序列，使得所述經(jīng)修飾的細胞系維持在未經(jīng)修飾的細胞中較不能繁殖或不能繁殖的痘病毒的繁殖。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞，其中所述細胞的基因組還包含在啟動子的控制下編碼D13L的序列。3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的細胞，其中所述細胞的基因組還包含在啟動子的控制下編碼K1L的序列。4.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的細胞，其中所述細胞是連續(xù)細胞系。5.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的細胞，其中所述細胞是CHO細胞。6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的細胞，其中所述細胞是人細胞、靈長動物細胞、倉鼠細胞或兔細胞。7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的細胞，其中所述CP77基因的表達是在哺乳動物啟動子的控制下。8.根據(jù)權(quán)利要求2至7中任一項所述的細胞，其中所述D13L基因的表達是在哺乳動物啟動子的控制下。9.根據(jù)權(quán)利要求...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：P·M·豪利，劉良，
申請(專利權(quán))人：賽門蒂斯有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：澳大利亞;AU