一種基于負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的免疫傳感器的制備方法及應用技術

本發(fā)明專利技術屬于新型功能材料與生物傳感檢測技術領域，提供了一種基于負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的免疫傳感器的制備方法及應用。具體是采用負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯作為標記物，制備了一種檢測腫瘤標志物CA199、CA25抗原的電化學免疫傳感器。

Preparation method and application of graphene based immunosensor based on loading TaC and gold coated ten face Silver Nanoparticles

The invention belongs to the technical field of novel functional materials and biological sensing detection, and provides a preparation method and an application of an immune sensor of graphene based on a load TaC and a ten face silver nanometer particle of Jin Baofu. Specifically, an electrochemical immunosensor for detecting tumor markers CA199 and CA25 antigen was prepared by using graphene with supported TaC and gold coated ten body silver nanoparticles as markers.

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術屬于免疫分析和生物傳感
，提供了一種負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯實現(xiàn)信號放大的免疫傳感器的制備方法及應用。
技術介紹
腫瘤標志物的靈敏檢測，在臨床上對于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)，腫瘤高危人群的篩選、良性和惡性腫瘤的鑒別診斷、腫瘤發(fā)展程度的判斷，腫瘤的治療效果的觀察和評價及腫瘤復發(fā)和預后的預測產生極大的影響，引起人們的廣泛關注。電化學免疫傳感器已經廣泛用于腫瘤標志物的檢測，夾心型電化學免疫傳感器結合了高特異性的免疫分析技術和高靈敏的電化學分析技術，具有靈敏度高、制備簡單、檢測快速、成本低等優(yōu)點，在臨床檢驗、環(huán)境監(jiān)測、食品安全控制、生物監(jiān)測等領域都有重要的應用價值。本專利技術中使用的石墨烯是褶皺的二維平面薄膜，具有大的比表面積，良好的電子傳遞能力和催化性能，能有效吸附固載抗體。TaC納米片高溫還原在石墨烯表面，有效地避免了石墨烯片層的堆疊，TaC具有鉑族金屬的電子結構以及在費米能級上的相似性，具有和貴金屬類似的催化活性。此外，相對于過渡金屬氧化物（TMO）和過渡金屬硫化物（TMS），TaC在酸堿環(huán)境中具有更高的穩(wěn)定性。十面體的銀納米粒子（AgDeNps）相對于銀納米微球，擁有更多的催化活性位點，但銀納米粒子的穩(wěn)定性相對較差，均勻包覆的金納米粒子可以有效的提高銀納米粒子的穩(wěn)定性。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術提供了一種基于負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的免疫傳感器的制備方法及應用，實現(xiàn)了對腫瘤標志物的超靈敏檢測。本專利技術的目的之一是提供一種基于負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的免疫傳感器的制備方法。本專利技術的目的之二是將所制備的基于負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的免疫傳感器應用于腫瘤標志物的高靈敏、特異性檢測。本專利技術的技術方案，包括以下步驟。1.一種基于負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的免疫傳感器的制備方法，步驟如下：（1）將直徑為3mm的玻碳電極用Al2O3拋光粉打磨，超純水清洗干凈；（2）將上述電極置于質量分數(shù)為0.8%~1.0%的HAuCl4溶液中，在-0.2V下掃描30s,在電極表面形成電沉積金基底，用超純水沖洗，晾干；（3）繼續(xù)將6μL、10~15μg/mL的腫瘤標志物捕獲抗體滴加到電極表面，超純水沖洗，4℃冰箱中干燥；（4）繼續(xù)將3μL、1.0~3.0mg/mL的牛血清白蛋白溶液滴加到電極表面，超純水沖洗電極表面，4℃冰箱中晾干；（5）滴加6μL、0.0005~40ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標志物抗原溶液，超純水沖洗電極表面，4℃冰箱中干燥；（6）將6μL、3~5mg/mL的負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的檢測抗體孵化物溶液，滴涂于電極表面上，置于4℃冰箱中晾干，制得一種基于負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的免疫傳感器。2.如權利要求1所述的一種基于負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的免疫傳感器的制備方法，所述金包覆十面體銀納米粒子的制備，步驟如下：（1）十面體銀納米粒子溶液的制備取13~15mL的超純水加入到20mL的燒杯中，依次緩慢加入0.05mol/L、0.5mL檸檬酸鈉，0.05mol/L、22.5μL聚對苯乙烯磺酸鈉，0.05mol/L、50μL精氨酸，0.05mol/L、0.4mL硝酸銀，新配制的0.1mol/L、0.1~0.3mL硼氫化鈉，溶液由淡黃色變?yōu)榱咙S色；600rpm條件下持續(xù)攪拌45min，加入0.2~0.4mL、30%H2O2，繼續(xù)攪拌30min，生成的溶液置于藍色的LED燈光下13~15h，制得十面體銀納米粒子的溶液，置于4℃冰箱中保存，備用；（2）金包覆十面體銀納米粒子的制備將新配置的質量分數(shù)為0.1%、1.0~2.0mL氯金酸水溶液緩慢加入到3.0mL的十面體銀納米粒子的溶液中，震蕩至溶液由黃色變?yōu)榫萍t色，制得金包覆十面體銀納米粒子的溶液；3.如權利要求1所述的一種基于負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的免疫傳感器的制備方法，所述負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的檢測抗體孵化物溶液的制備，步驟如下：（1）負載TaC的石墨烯的制備①石墨烯的制備在冰水浴和攪拌條件下，將2.0~3.0g天然石墨粉緩緩地加入到45~60mL濃硫酸中，持續(xù)攪拌15~25min；邊攪拌邊依次加入10.0~15.0gKMnO4和5.0~7.5gNaNO3，保持溶液溫度低于20℃，攪拌10~15min，再升溫至40℃，持續(xù)攪拌30~40min，加入50~75mL的超純水，將溶液置于油浴鍋中，95℃下加熱30~40min；將200mL的超純水和10~15mL、30%的H2O2加入到上述溶液中，反應至溶液由黑褐色變?yōu)辄S色，分別用1mol/LHCl和超純水洗滌三次；65℃真空干燥12h備用；②負載TaC的石墨烯的制備將上述制備的0.1~0.2g石墨烯分散在200mL的超純水中，超聲2h，加入0.05~0.1gK2TaF7繼續(xù)超聲30~50min，將混合液置于油浴鍋中，90℃下攪拌，蒸發(fā)掉大部分的水，直至變?yōu)槟z狀；將凝膠狀液體置于表面皿中，在0℃下冷凍干燥12~16h，得到疏松多孔海綿狀固體產物，將所得固體在氬氣保護、1200℃下煅燒2h，得到負載TaC的石墨烯；（2）負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的制備取5~7mg負載TaC的石墨烯加入到3.0mL金包覆十面體銀納米粒子的溶液中，超聲30min，形成負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯溶液，離心；分別用無水乙醇及超純水洗滌三次、30℃真空干燥24h，得到負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯固體粉末；（3）負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的檢測抗體孵化物溶液的制備將6~10mg的負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯固體粉末溶于1mL的pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，震蕩溶解，再加入100μL、80~120μg/mL的腫瘤標志物檢測抗體溶液和900μL、50mmol/L的pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液，4℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩，孵化12h，制得負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的檢測抗體孵化物溶液，4℃下保存?zhèn)溆谩?.如權利要求1所述的制備方法制備的一種基于負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的免疫傳感器，用于腫瘤標志物的檢測，檢測步驟如下：（1）使用電化學工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，所制備的傳感器為工作電極，在10mL、50mmol/L的pH5.0~8.0磷酸鹽緩沖溶液中進行測試；（2）用時間-電流法對分析物進行檢測，輸入電壓為-0.4V，取樣間隔0.1s，運行時間400s；（3）當背景電流趨于穩(wěn)定后，每隔50s向10mL、50mmol/L的pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液中注入10μL、5mol/L的雙氧水溶液，記錄電流變化。上述所述腫瘤標志物選自下列之一：CA199、CA125。本專利技術所用原材料均可在化學試劑公司或生物制藥公司購買。本專利技術的有益成果（1）本專利技術使用了負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯納米復合材料，石墨烯有大的比表面積，可增加抗體的結合位點，石墨烯氧化得石墨烯，是親水性物質，在水中有優(yōu)越的分散性，且羧基能本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種基于負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的免疫傳感器的制備方法，其特征在于，步驟如下：（1）將直徑為3?mm的玻碳電極用Al2O3拋光粉打磨，超純水清洗干凈；（2）將上述電極置于質量分數(shù)為0.8%?~?1.0%的HAuCl4溶液中，在?0.2V下掃描30s,在電極表面形成電沉積金基底，用超純水沖洗，晾干；（3）繼續(xù)將6?μL、10?~?15?μg/mL的腫瘤標志物捕獲抗體滴加到電極表面，超純水沖洗，4℃冰箱中干燥；（4）繼續(xù)將3?μL、1.0?~?3.0?mg/mL的牛血清白蛋白溶液滴加到電極表面，超純水沖洗電極表面，4?℃冰箱中晾干；（5）滴加6?μL、0.0005?~?40?ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標志物抗原溶液，超純水沖洗電極表面，4℃冰箱中干燥；（6）將6?μL、3?~?5mg/mL的負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的檢測抗體孵化物溶液，滴涂于電極表面上，置于4℃冰箱中晾干，制得一種基于負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的免疫傳感器。

【技術特征摘要】
1.一種基于負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的免疫傳感器的制備方法，其特征在于，步驟如下：（1）將直徑為3mm的玻碳電極用Al2O3拋光粉打磨，超純水清洗干凈；（2）將上述電極置于質量分數(shù)為0.8%~1.0%的HAuCl4溶液中，在-0.2V下掃描30s,在電極表面形成電沉積金基底，用超純水沖洗，晾干；（3）繼續(xù)將6μL、10~15μg/mL的腫瘤標志物捕獲抗體滴加到電極表面，超純水沖洗，4℃冰箱中干燥；（4）繼續(xù)將3μL、1.0~3.0mg/mL的牛血清白蛋白溶液滴加到電極表面，超純水沖洗電極表面，4℃冰箱中晾干；（5）滴加6μL、0.0005~40ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標志物抗原溶液，超純水沖洗電極表面，4℃冰箱中干燥；（6）將6μL、3~5mg/mL的負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的檢測抗體孵化物溶液，滴涂于電極表面上，置于4℃冰箱中晾干，制得一種基于負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的免疫傳感器。2.如權利要求1所述的一種基于負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的免疫傳感器的制備方法，所述金包覆十面體銀納米粒子的制備，步驟如下：（1）十面體銀納米粒子溶液的制備取13~15mL的超純水加入到20mL的燒杯中，依次緩慢加入0.05mol/L、0.5mL檸檬酸鈉，0.05mol/L、22.5μL聚對苯乙烯磺酸鈉，0.05mol/L、50μL精氨酸，0.05mol/L、0.4mL硝酸銀，新配制的0.1mol/L、0.1~0.3mL硼氫化鈉，溶液由淡黃色變?yōu)榱咙S色；600rpm條件下持續(xù)攪拌45min，加入0.2~0.4mL、30%H2O2，繼續(xù)攪拌30min，生成的溶液置于藍色的LED燈光下13~15h，制得十面體銀納米粒子的溶液，置于4℃冰箱中保存，備用；（2）金包覆十面體銀納米粒子的制備將新配置的質量分數(shù)為0.1%、1.0~2.0mL氯金酸水溶液緩慢加入到3.0mL的十面體銀納米粒子的溶液中，震蕩至溶液由黃色變?yōu)榫萍t色，制得金包覆十面體銀納米粒子的溶液。3.如權利要求1所述的一種基于負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的免疫傳感器的制備方法，所述負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的檢測抗體孵化物溶液的制備，步驟如下：（1）負載TaC的石墨烯的制備①石墨烯的制備在冰水浴和攪拌條件下，將2.0~3.0g天然石墨粉緩緩地加入到45~60mL濃硫酸中，持續(xù)攪拌15~25min；邊攪拌邊依次加入10.0~15.0gKMnO4和5.0~7.5gNaNO...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：李月云，張曉波，高增強，呂慧，馮金慧，蘇曉楠，劉豐碩，董云會，
申請(專利權)人：山東理工大學，
類型：發(fā)明
國別省市：山東;37