呋喃西林代謝物SEM衍生化半抗原、人工抗原的制備方法及其應用技術

本發明專利技術公開了一種呋喃西林代謝物SEM衍生化半抗原、人工抗原的制備方法及其應用，所述的半抗原引入的活性手臂，完整的保留了SEM衍生物的特征結構，對其電子云密度無影響，又具有可以與載體蛋白偶聯的活性基團，反應條件溫和，操作步驟簡單；制備的人工抗原可與抗體特異性的結合，具有高效價、高靈敏度、高精確性等特點，可快速檢測各類產品中呋喃西林代謝物SEM的殘留。

【技術實現步驟摘要】
呋喃西林代謝物SEM衍生化半抗原、人工抗原的制備方法及其應用
本專利技術涉及免疫化學
，尤其涉及一種呋喃西林代謝物SEM衍生化半抗原、人工抗原的制備方法及其應用。
技術介紹
呋喃類是人工合成的一類共有5-硝基呋喃環結構的抗生素，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、部分真菌都具有抗菌效果。因價格低廉，被廣泛地應用在畜禽和魚類養殖中，用于治療由沙門氏桿菌、大腸桿菌引起的腸炎，球蟲病等，并且常作為畜牧動物以及水產魚蝦類的生長促進劑被添入飼料中。硝基呋喃類主要包括：呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮。但在食品安全中，呋喃西林的大量或連續使用不僅對養殖動物有毒性作用，而且具有致癌、致畸、致突變作用，其代謝物還對人類健康有惡性影響。因此，許多國家已經明令禁止在飼養動物源性食品過程中使用呋喃西林，并規定了在動物源性食品中的檢驗檢疫標準。目前用于檢測呋喃西林及其代謝物的方法主要有傳統的檢測方法，如分光光度法、高效液相色譜法及其聯用技術等，以上方法雖然可以精確定量，但由于設備儀器昂貴，檢測時間長，且需專業人員操作，因此無法實現真正意義上的現場檢測；以及免疫學檢測技術，此方法具有高特異性和高選擇性的特點，非常適用于復雜基質痕量組分的分離或檢測，隨著學科間的相互滲透，其檢測方法層出不窮，應用范圍亦日益擴大，與傳統檢測方法相比，免疫學檢測技術具有經濟、快速、技術要點低、操作簡便等特點。免疫分析檢測技術是近年來在環境及食品檢測等領域開發出來的一種新型快速準確檢測方法，現已逐漸成為世界各國有毒有害殘留物快速篩選檢測的主要方法之一，也為呋喃西林的檢測提供了新的途徑。雖然呋喃西林代謝物本身具有活性基團，但由于其分子量較小，空間結構不突出，直接制備的人工抗原存在靈敏度低的重大不足，無法滿足現有市場的需求。因此需先通過化學方法設計出其半抗原，再進一步與載體蛋白結合獲得具有免疫原性的完全抗原。在專利公告號為“CN200710026406.7，CN201210049821.5”的專利文件中，其設計的半抗原結構為傳統的4-CP衍生物結構，均無法保留其待測目標物的硝基端，使得半抗原、抗原制備獲得的抗體均存在特異性差、親和力低等不足。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是克服傳統的SEM半抗原無法完整保留競爭物特征結構的缺陷，提供一種呋喃西林代謝物SEM衍生化半抗原、人工抗原的制備方法及其應用，其可保留競爭物硝基端的半抗原，人工抗原，提高競爭物的特異性。本專利技術解決該技術問題所采用的技術方案是：一種呋喃西林代謝物的半抗原，為如下結構式Ⅲ：本專利技術解決該技術問題所采用的另一技術方案是，一種呋喃西林代謝物的半抗原的制備方法，步驟如下：(a)將化合物Ⅰ溶解于乙醇中，所得溶液通過添加6mol/L的氫氧化鋰溶液將PH值調至10-11，反應獲得化合物Ⅱ；所述化合物Ⅰ的結構式為：所述化合物Ⅱ的結構式為：(b)將所述化合物Ⅱ與呋喃西林代謝物在甲醇條件下反應，既得呋喃西林代謝物的半抗原，其為如下結構式Ⅲ；本專利技術解決該技術問題所采用的另一技術方案是，一種呋喃西林代謝物的半抗原的制備方法，步驟如下：(a’)將化合物Ⅰ溶于乙醇中，所得溶液通過添加6mol/L的氫氧化鋰溶液將PH值調至10-12，室溫反應15-26h，加入純化水，所得溶液通過添加1M的稀鹽酸將PH值調至4-5，過濾得到化合物Ⅱ，所述化合物Ⅰ反應生成化合物Ⅱ的過程如下：(b’)將化合物Ⅱ溶解于甲醇中，加1.2-1.5摩爾當量的呋喃西林代謝物SEM，于60～70℃反應2h，反應完畢，過濾，得所述呋喃西林代謝物的半抗原，其為結構式Ⅲ，且所述半抗原的反應過程如下：本專利技術解決該技術問題所采用的另一技術方案是，一種呋喃西林代謝物的人工抗原，是載體蛋白和所述呋喃西林代謝物的半抗原偶聯得到的偶聯物，其為如下結構式IV：其中，所述載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)，人血清白蛋白(HAS)或血藍蛋白(KLH)中的任意一種。本專利技術解決該技術問題所采用的另一技術方案是，一種呋喃西林代謝物的人工抗原的制備方法，步驟如下：(1)取所述呋喃西林代謝物的半抗原，溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，攪拌充分后，加入碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，所述半抗原、碳二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺的重量比為5：4：3，室溫下攪拌4-8h，即可得到半抗原活化酯；(2)稱取載體蛋白，所述載體蛋白與所述半抗原的摩爾當量比為30：1，使所述載體蛋白充分溶解在0.01mol/L的PBS溶液中，在攪拌下將半抗原活化酯逐滴緩慢滴加至所述載蛋白溶液中，并在室溫下攪拌16-24h；(3)步驟(2)所得溶液通過0.01mol/L的PBS溶液室溫透析3天，每天換3次透析液；(4)分裝，于4℃保存備用。其中，所述載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)，人血清白蛋白(HAS)或血藍蛋白(KLH)中的任意一種。本專利技術解決該技術問題所采用的另一技術方案是，一種呋喃西林代謝物的單克隆抗體的制備方法，步驟依次如下：(i)以所述的呋喃西林代謝物的人工抗原為免疫原，與等體積弗氏佐劑乳化后，免疫BALB/C小鼠；每只鼠免疫劑量為50～100ug，免疫間隔3周，免疫3次；(ii)采步驟(i)處理后的小鼠尾部靜脈血檢測血清效價，如抗體效價不達60000，需加強免疫，待抗體效價不再升高后，以100μg免疫原進行皮下加強免疫，5天后取小鼠的脾細胞與SP20細胞融合；(iii)融合后的細胞在HAT培養基中篩選，5天后以完全培養基替換成HAT培養基進行培養；(iv)用ELISA對所述步驟(iii)處理后的細胞上清進行檢測，將檢測結果為強陽性的孔內細胞進行有限稀釋法克隆培養，經3次克隆培養檢測后，均呈陽性的孔內細胞即為分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞；(v)將所述雜交瘤細胞放大培養后，接種至小鼠腹腔，產生含抗體的腹水，用辛酸-硫酸銨沉淀法純化腹水，既得。所述制備方法可以得到高純度、高特異性的單克隆抗體，所述單克隆抗體在檢測水產品中呋喃西林代謝物殘留分析中應用。本專利技術解決該技術問題所采用的另一技術方案是，呋喃西林代謝物的人工抗原和呋喃西林代謝物的單克隆抗體在檢測呋喃西林代謝物中的應用，包括如下步驟：將所述的人工抗原作為包被原包被在酶標板上，將所述的單克隆抗體加入微孔板中；采用競爭法檢測待檢樣本中呋喃西林代謝物的含量。與現有技術相比，具有如下積極效果：傳統方案的SEM半抗原結構均無法保留待測物的硝基端，使得半抗原、抗原制備獲得的抗體均存在特異性差、親和力低等不足。本專利技術中提供了一種新型SEM衍生物半抗原，以及基于該半抗原制備的一種人工抗原，闡述了兩者的制備方法與應用。其思路是將SEM衍生化，獲得具有活性基團和雙鍵剛性支撐手臂的衍生物，同時還完整的保留了SEM衍生物的特征結構，對其電子云密度無影響，同時為了增強半抗原的免疫原性制備出高質量的抗體，該抗體可以特異性識別SEM衍生物。該思路的有益效果體現在：(1)引入具有剛性支撐作用的雙鍵手臂，使得SEM的結構特征明顯增強，利于決定簇的良好呈現；(2)制備的半抗原完整的保留了SEM衍生物的特征結構，對其電子云密度無影響，使得小分子半抗原的免疫原性明顯增強，有利于刺激動物免疫應答產生特異性更強、靈敏度更高的抗體；(3)本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種呋喃西林代謝物的半抗原，其特征在于，為如下結構式Ⅲ：

【技術特征摘要】
1.一種呋喃西林代謝物的半抗原，其特征在于，為如下結構式Ⅲ：2.一種呋喃西林代謝物的半抗原的制備方法，其特征在于，步驟如下：(a)將化合物Ⅰ溶解于乙醇中，通過氫氧化鋰溶液將PH值調至10-11，反應獲得化合物Ⅱ；所述化合物Ⅰ的結構式為：所述化合物Ⅱ的結構式為：(b)將所述化合物Ⅱ與呋喃西林代謝物在甲醇條件下反應，既得呋喃西林代謝物的半抗原，其為如下結構式Ⅲ；3.一種呋喃西林代謝物的半抗原的制備方法，其特征在于，步驟如下：(a’)將化合物Ⅰ溶于乙醇中，通過氫氧化鋰溶液將PH值調至10-12，進行反應，加入純化水，通過稀鹽酸將PH值調至4～5，過濾得到化合物Ⅱ，所述化合物Ⅰ反應生成所述化合物Ⅱ的過程如下：(b’)將所述化合物Ⅱ溶解于甲醇中，加1.2-1.5摩爾當量的呋喃西林代謝物SEM，于60～70℃反應，反應完畢，過濾，得呋喃西林代謝物的半抗原，所述半抗原為結構式Ⅲ及其合成過程如下：4.一種呋喃西林代謝物的人工抗原，其特征在于：是載體蛋白和權利要求1所述呋喃西林代謝物的半抗原偶聯得到的偶聯物，其為如下結構式IV：5.根據權利要求4所述的呋喃西林代謝物的人工抗原，其特征在于：所述載體蛋白為牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血藍蛋白中的任意一種。6.一種呋喃西林代謝物的人工抗原的制備方法，其特征在于，步驟如下：(1)取權利要求1所述的呋喃西林代謝物的半抗原，溶解于二甲基甲酰胺中，攪拌后，加入碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，所述半抗原、碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的重量比為5：4：3，室溫下攪拌，即得半抗原活化酯；(2)稱取載體蛋白，所述載體蛋白與所述半抗原的摩爾量比為30：1，使所述載體蛋白充分溶解...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李斌，胡睿，
申請(專利權)人：廣州潤坤生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：廣東,44