酚酞半抗原、人工抗原及其制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及酚酞半抗原、人工抗原及其制備方法。本發(fā)明專利技術(shù)半抗原在保留酚酞基本結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上引入連接臂結(jié)構(gòu)和用于偶聯(lián)大分子的活性基團(tuán)，這樣既有利于其與大分子偶聯(lián)，又可以在偶聯(lián)后充分暴露本身分子結(jié)構(gòu)和分子量較小的酚酞基本結(jié)構(gòu)，避免了其被大分子掩蔽而影響動(dòng)物機(jī)體的識(shí)別。本發(fā)明專利技術(shù)通過(guò)活性酯化法將半抗原與蛋白質(zhì)偶聯(lián)制備人工抗原，偶聯(lián)比可達(dá)18.2，可用于酚酞的免疫檢測(cè)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
酚酞半抗原、人工抗原及其制備方法
本專利技術(shù)涉及生物
，特別涉及酚酞半抗原、人工抗原及其制備方法。
技術(shù)介紹
酚酞(Phenolphthalein)，3,3-雙(4-羥基苯基)-1(3H)-異苯并呋喃酮，可作用于腸平滑肌，使腸蠕動(dòng)增加，同時(shí)又能抑制腸道內(nèi)水分的吸收，使水和電解質(zhì)在結(jié)腸蓄積，產(chǎn)生緩瀉作用，臨床常用于治療習(xí)慣性頑固性便秘。其作用緩和，很少引起腸道痙攣。但酚酞具有一定的不良反應(yīng)，包括：由酚酞引起的過(guò)敏反應(yīng)臨床上罕見(jiàn)，偶能引起皮炎、藥疹、瘙癢、灼痛及腸炎、出血傾向等。禁忌癥包括闌尾炎、直腸出血未明確診斷、充血性心力衰竭、高血壓、糞塊阻塞、腸梗阻。藥物過(guò)量或長(zhǎng)期濫用時(shí)可造成電解質(zhì)紊亂，誘發(fā)心律失常、神志不清、肌痙攣以及倦怠無(wú)力等癥狀。近年來(lái)，減肥類中藥或保健品中非法添加酚酞以達(dá)到臨床的療效的新聞屢見(jiàn)報(bào)道。如果患者在長(zhǎng)期不知情的情況下服用含有酚酞的中成藥或保健品會(huì)引起嚴(yán)重的副作用。因此，急需開(kāi)發(fā)快速準(zhǔn)確的酚酞檢測(cè)手段和方法用于監(jiān)管執(zhí)法和科學(xué)研究。目前，檢測(cè)中成藥或保健品中是否含有酚酞成分，采用的是傳統(tǒng)的檢驗(yàn)方法，須將提取的樣品帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行大型儀器分析耗時(shí)長(zhǎng)，成本高。免疫分析是一種基于抗原抗體特異性識(shí)別和結(jié)合反應(yīng)的分析方法，具有靈敏、對(duì)儀器要求不高、操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)。酚酞屬于分子量小于1000的小分子化合物，本身不具備反應(yīng)性和免疫原性，為了實(shí)現(xiàn)酚酞的免疫檢測(cè)，不僅需要合成具備高效價(jià)的酚酞抗原，而且還需要篩選特異性強(qiáng)、敏感度高的酚酞單克隆抗體。但是目前尚未有有關(guān)酚酞單克隆抗體的相關(guān)報(bào)道。對(duì)于技術(shù)人員來(lái)說(shuō)高效價(jià)的酚酞抗原的設(shè)計(jì)仍是難點(diǎn)。專利技術(shù)內(nèi)容有鑒于此，本專利技術(shù)提供了酚酞半抗原、人工抗原及其制備方法。本專利技術(shù)半抗原在保留酚酞基本結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上引入連接臂結(jié)構(gòu)和用于偶聯(lián)大分子的活性基團(tuán)，這樣既有利于其與大分子偶聯(lián)，又可以在偶聯(lián)后充分暴露本身分子結(jié)構(gòu)和分子量較小的酚酞基本結(jié)構(gòu)，避免了其被大分子掩蔽而影響動(dòng)物機(jī)體的識(shí)別。本專利技術(shù)通過(guò)活性酯化法將半抗原與蛋白質(zhì)偶聯(lián)制備人工抗原，偶聯(lián)比可達(dá)18.2，可用于酚酞的免疫檢測(cè)。為了實(shí)現(xiàn)上述專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)提供以下技術(shù)方案：本專利技術(shù)提供了一種酚酞半抗原，其分子結(jié)構(gòu)式如式I或式II所示：其中，n為1、2或3，m為1、2或3。本專利技術(shù)還提供了式I所示酚酞半抗原的制備方法，包括如下步驟：酚酞與脂肪類二胺反應(yīng)，得到酚酞半抗原；脂肪類二胺為乙二胺、丙二胺或丁二胺。本專利技術(shù)還提供了式II所示酚酞半抗原的制備方法，包括如下步驟：酚酞與脂肪類二胺反應(yīng)，得到氨基化酚酞；氨基化酚酞與環(huán)狀酸酐反應(yīng)，得到酚酞半抗原；脂肪類二胺為乙二胺、丙二胺或丁二胺；環(huán)形酸酐為丁二酸酐、戊二酸酐或己二酸酐。作為優(yōu)選，酚酞與脂肪類二胺反應(yīng)的溫度為120～130℃，反應(yīng)的時(shí)間為12～14h。優(yōu)選地，酚酞與脂肪類二胺反應(yīng)的溫度為130℃，反應(yīng)的時(shí)間為12h。作為優(yōu)選，酚酞與脂肪類二胺的質(zhì)量比為1：(4～10)。在本專利技術(shù)提供的實(shí)施例中，酚酞與脂肪類二胺的質(zhì)量比為1：8。在本專利技術(shù)提供的實(shí)施例中，酚酞與脂肪類二胺反應(yīng)具體為：酚酞與脂肪類二胺混合，加熱至130℃攪拌反應(yīng)12h，產(chǎn)物減壓濃縮至近干，得油狀粗產(chǎn)物；加入純凈水，超聲分散洗滌后，抽濾收集固體，干燥。在本專利技術(shù)提供的實(shí)施例中，氨基化酚酞與環(huán)形酸酐反應(yīng)的溶劑為DMF。作為優(yōu)選，氨基化酚酞與環(huán)形酸酐反應(yīng)的條件為弱堿性、密閉條件。作為優(yōu)選，弱堿性條件的pH值為7.5。在本專利技術(shù)提供的實(shí)施例中，弱堿性反應(yīng)條件通過(guò)加入三乙胺實(shí)現(xiàn)。作為優(yōu)選，氨基化酚酞與環(huán)形酸酐反應(yīng)的時(shí)間為10～12h。作為優(yōu)選，氨基化酚酞與環(huán)形酸酐反應(yīng)的溫度為40～50℃。作為優(yōu)選，氨基化酚酞與環(huán)形酸酐的質(zhì)量比為1：(2～5)。在本專利技術(shù)提供的實(shí)施例中，氨基化酚酞與環(huán)形酸酐的質(zhì)量比為1：5。在本專利技術(shù)提供的實(shí)施例中，氨基化酚酞與環(huán)狀酸酐反應(yīng)具體為：將氨基化酚酞與環(huán)形酸酐混合，溶解于DMF中，然后逐滴加入少量三乙胺，40～50℃密閉攪拌反應(yīng)10～12h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液傾入水中，用乙酸乙酯多次萃取，合并萃取液，以無(wú)水Na2SO4進(jìn)行干燥，濃縮后得到固體，重結(jié)晶得到固體產(chǎn)物。本專利技術(shù)還提供了一種酚酞人工抗原，其分子結(jié)構(gòu)式如式III或式IV所示：其中，n為1、2或3，m為1、2或3。本專利技術(shù)還提供了式III或式IV所示酚酞人工抗原的制備方法，其采用活性酯化法制備酚酞人工抗原。在本專利技術(shù)提供的實(shí)施例中，酚酞人工抗原的制備方法包括如下步驟：將本專利技術(shù)提供的酚酞半抗原、EDC、NHS在有機(jī)溶劑中反應(yīng)，得到一號(hào)反應(yīng)液；將載體蛋白與磷酸緩沖液混合，得到二號(hào)反應(yīng)液；一號(hào)反應(yīng)液與二號(hào)反應(yīng)液反應(yīng)，得到酚酞人工抗原。作為優(yōu)選，有機(jī)溶劑為DMF。作為優(yōu)選，將酚酞半抗原、EDC、NHS在有機(jī)溶劑中反應(yīng)的條件為15～30℃、避光條件下攪拌反應(yīng)12～14h。作為優(yōu)選，一號(hào)反應(yīng)液與二號(hào)反應(yīng)液反應(yīng)具體為：將一號(hào)反應(yīng)液滴入二號(hào)反應(yīng)液，在15～30℃、避光條件下攪拌反應(yīng)30～60min，然后在3～5℃、避光條件下攪拌反應(yīng)46～50h。作為優(yōu)選，一號(hào)反應(yīng)液與二號(hào)反應(yīng)液反應(yīng)與得到酚酞人工抗原之間還包括純化、干燥的步驟。作為優(yōu)選，純化為：將反應(yīng)液進(jìn)行離心處理，并將上清液置于裝有pH值為7.0～7.5磷酸鹽緩沖液的分子截留為20000～30000的透析袋中，在3～5℃的條件下進(jìn)行透析46～50小時(shí)，每隔6～8小時(shí)換一次磷酸鹽緩沖液，保留透析袋中所得溶液。作為優(yōu)選，酚酞半抗原、EDC、NHS的質(zhì)量比為1：(5～8)：(10～13)。優(yōu)選地，酚酞半抗原、EDC、NHS的質(zhì)量比為1：8：13。作為優(yōu)選，以質(zhì)量比計(jì)，1份載體蛋白與10～12份磷酸緩沖液混合。作為優(yōu)選，載體蛋白與酚酞半抗原的質(zhì)量比為1：(15～25)。作為優(yōu)選，載體蛋白為牛血清蛋白BSA。在本專利技術(shù)提供的實(shí)施例中，將一號(hào)反應(yīng)液滴入二號(hào)反應(yīng)液為：將一號(hào)反應(yīng)液按每5秒1滴的速度滴入二號(hào)反應(yīng)液。本專利技術(shù)提供了酚酞半抗原、人工抗原及其制備方法。酚酞半抗原的分子結(jié)構(gòu)式如式I、II所示，其人工抗原的分子結(jié)構(gòu)式如式III、IV所示。本專利技術(shù)的有益效果為：本專利技術(shù)以酚酞為原料，與脂肪二胺反應(yīng)，得到氨基化的酚酞(半抗原)；或者酚酞與脂肪二胺反應(yīng)再與環(huán)狀酸酐反應(yīng)，得到羧基化的酚酞衍生物(半抗原)。該半抗原在保留酚酞基本結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上引入連接臂(linker)結(jié)構(gòu)和用于偶聯(lián)大分子的活性基團(tuán)，這樣既有利于其與大分子偶聯(lián)，又可以在偶聯(lián)后充分暴露本身分子結(jié)構(gòu)和分子量(318)較小的酚酞基本結(jié)構(gòu)，避免了其被大分子掩蔽而影響動(dòng)物機(jī)體的識(shí)別。本專利技術(shù)通過(guò)活性酯化法將半抗原與蛋白質(zhì)偶聯(lián)制備人工抗原，偶聯(lián)比可達(dá)18.2，可用于酚酞的免疫檢測(cè)。此方法獲得的人工合成抗原可進(jìn)一步制備抗體，運(yùn)用到膠體金試紙中，此膠體金試紙可用于食品保健品非法添加酚酞類化合物的快速篩查。附圖說(shuō)明圖1示試驗(yàn)例1中BSA、酚酞(PH)、PH-BSA的紫外全波譜掃描圖；圖2示對(duì)比例1中BSA、酚酞(PH)、PH-BSA的紫外全波譜掃描圖。具體實(shí)施方式本專利技術(shù)公開(kāi)了酚酞半抗原、人工抗原及其制備方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本專利技術(shù)。本專利技術(shù)的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種酚酞半抗原，其特征在于，其分子結(jié)構(gòu)式如式I或式II所示：

【技術(shù)特征摘要】
1.一種酚酞半抗原，其特征在于，其分子結(jié)構(gòu)式如式I或式II所示：其中，n為1、2或3，m為1、2或3。2.如式I所示酚酞半抗原的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：酚酞與脂肪類二胺反應(yīng)，得到酚酞半抗原；所述脂肪類二胺為乙二胺、丙二胺或丁二胺。3.如式II所示酚酞半抗原的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：酚酞與脂肪類二胺反應(yīng)，得到氨基化酚酞；所述氨基化酚酞與環(huán)狀酸酐反應(yīng)，得到酚酞半抗原；所述脂肪類二胺為乙二胺、丙二胺或丁二胺；所述環(huán)形酸酐為丁二酸酐、戊二酸酐或己二酸酐。4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其特征在于，所述酚酞與脂肪類二胺反應(yīng)的溫度為120～130℃，反應(yīng)的時(shí)間為12～14h。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述氨基化酚酞與環(huán)形酸酐反應(yīng)的溶劑為DMF，反應(yīng)的條件為弱堿性、密閉條件、40～50℃下反應(yīng)10～12h。6.一種酚酞人工抗原，其特...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：盧宇靖，蔡森源，郭曉路，黃寶華，張焜，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：廣東工業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：廣東,44