一種與卵巢癌相關的環狀非編碼RNA-PUM1的shRNA和應用制造技術

本發明專利技術屬于腫瘤分子生物學技術領域，具體涉及一種與卵巢癌相關的環狀RNA?PUM1的shRNA和應用。針對circPUM1基因設計的shRNA，具體為shRNA1或shRNA2；所述的環狀RNA?PUM1可作為卵巢癌診斷和治療的重要靶點。所述的與卵巢癌相關的環狀RNA?PUM1的shRNA可以用于制備抗卵巢癌藥物。

【技術實現步驟摘要】
一種與卵巢癌相關的環狀非編碼RNA-PUM1的shRNA和應用
本專利技術屬于腫瘤分子生物學
，具體涉及一種與卵巢癌相關的環狀RNAPUM1的shRNA和應用。技術背景卵巢癌是女性生殖系統死亡率最高的惡性疾病，發病率居婦科腫瘤第三位，其較高的死亡率由于大多數患者確診時已為晚期，手術治療后常發生復發和轉移，遠期預后差。因此，探索卵巢癌發生發展的分子生物學機制對于卵巢癌的早期診斷、預后判斷及個體化靶向治療具有重要意義。近年來隨著高通量測序等技術的不斷進展，環狀RNA（circRNA）越來越多地進入研究者的視野，環狀RNA是一種高度保守的閉合的非編碼RNA，富含微小RNA（miRNA）結合位點，能夠吸附并解除miRNA對靶基因的抑制作用，調控腫瘤發生、發展通路中癌基因或抑癌基因的表達，影響腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲及轉移能力。PUM（Homosapienspumilio）基因已被證實能夠影響細胞周期、增殖與分化、調控癌癥相關基因的表達，在腫瘤發生和進展中發揮著重要作用，但目前并沒有關于PUM1基因轉錄形成的circPUM1結構在卵巢癌組織中表達情況及作用機制的相關報道。
技術實現思路
針對上述問題，本專利技術提供PUM1基因在卵巢癌的診斷、治療及預后評估的應用，尤其是一種與卵巢癌相關的環狀RNAPUM1的shRNA和應用。該環狀RNA與癌細胞的增殖能力相關，針對其設計的shRNA可應用于抗腫瘤的藥物的制備。為了實現上述目的，本專利技術提供一種與卵巢癌相關的circPUM1基因，其DNA序列如SEQ.ID.NO.1所示；針對circPUM1基因設計的shRNA，具體為shRNA1或shRNA2；針對circPUM1設計shRNA1，所述的shRNA1的topstrand和bottomstrand的核苷酸序列分別SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示；針對circPUM1設計的shRNA2，所述的shRNA的topstrand和bottomstrand的核苷酸序列分別SEQ.ID.NO.4和SEQ.ID.NO.5所示。SEQ.ID.NO.2：GATTCTCAACAACAGGGCCCAAGGGATTCAAGAGATCCCTTGGGCCCTGTTGTTGAGAATTTTTTT。SEQ.ID.NO.3：AAAAAAATTCTCAACAACAGGGCCCAAGGGATCTCTTGAATCCCTTGGGCCCTGTTGTTGAGAATC。SEQ.ID.NO.4：GAACAACAGGGCCCAAGGGATGCAGATTCAAGAGATCTGCATCCCTTGGGCCCTGTTGTTTTTTTT。SEQ.ID.NO.5：AAAAAAAACAACAGGGCCCAAGGGATGCAGATCTCTTGAATCTGCATCCCTTGGGCCCTGTTGTTC。所述的環狀RNAPUM1可作為卵巢癌診斷和治療的重要靶點。所述的與卵巢癌相關的環狀RNAPUM1的shRNA可以用于制備抗卵巢癌藥物。本專利技術的有益效果。本專利技術首次發現circPUM1在卵巢癌組織中高表達，通過轉染shRNA能夠下調circPUM1的表達，顯著抑制癌細胞活性，為卵巢癌相關circRNA的臨床治療和科學研究提供了基礎。附圖說明圖1利用qRT-PCR檢測circPUM1在卵巢癌及正常組織中的表達情況。圖2circPUM1shRNA轉染后，卵巢癌細胞circPUM1表達情況的QRT-PCR。圖3利用MTT法檢測干擾circPUM1對卵巢癌細胞活性的影響。圖4檢測干擾circPUM1對卵巢癌細胞凋亡的影響。具體實施方式下面結合具體的實施例對本專利技術作進一步的說明，以下實施例將有助于對本專利技術的了解，但這些實施例僅為了對本專利技術加以說明，本專利技術并不限于這些內容。在實施例中未作特殊說明的操作方法均為本
常規操作方法。實施例1。一、circPUM1在卵巢癌組織、正常卵巢組織中的表達情況。1.標本采集。在患者知情的情況下，于術中采集卵巢癌、正常卵巢組織標本，生理鹽水清洗后，保存于液氮或-80℃超低溫冰箱中，備用；組織標本于2014年6月-2016年6月，在中國醫科大學附屬第一醫院手術室，由陳醫生采集。2.引物設計。circPUM1RT-PCR引物序列如SEQ.ID.NO.6-7所示。上游引物（SEQ.ID.NO.6）：AGTGTACTGGGAGGAGG。下游引物（SEQ.ID.NO.7）：ATAAGTCCGTGCGTCC。3.應用qRT-PCR方法分別檢測circPUM1在卵巢癌、正常卵巢組織的表達量。3.1總RNA抽提。使用RNA抽提試劑RNAisoPlus試劑（寶生物工程有限公司）從正常卵巢組織、卵巢癌組織分離總RNA。將勻漿液轉移至離心管中，室溫靜置5分鐘；4℃條件下12,000r離心處理5分鐘；小心吸取上清液，移入新的離心管中；加入RNAisoPlus的1/5體積量的氯仿，劇烈振蕩15秒，待溶液充分乳化后，室溫靜置5分鐘；4℃條件下，12,000r離心處理15分鐘，吸取上清液轉移至另一個新的離心管中，向上清液中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在30℃下靜置10分鐘；4℃條件下12,000r離心處理10分鐘，棄去上清，沿管壁加入lml的75％的乙醇，上下顛倒洗滌離心管管壁，4℃條件下12,000r離心處理5分鐘后，棄去乙醇，室溫干燥沉淀2-5分鐘，加入適量的RNase-free水溶解沉淀后，用UV-2800A型紫外可見分光光度計測定RNA濃度和純度（定量RNA濃度1ug/ul，OD260/OD2801.8-2.0之間表示RNA純度較高）。3.2逆轉錄合成cDNA。逆轉錄試劑盒HighCapacitycDNAReverseTranscriptionKits購自Invitrogen公司，定量PCR試劑盒PowerSYBRGreenPCRMasterMix購自Invitrogen公司。采用GoScript反轉錄系統（A5000、A5001），按照以下操作步驟進行反轉錄得到的cDNA。第一步：取一定量模板RNA加入引物。RNA(1μg/ul)5μl。RandomPrimers(0.5μg/ul)1μl。Oligo(dT)15Primer(0.5μg/ul)1μl。Nuclease-FreeWater(加至10μl)3μl。第二步：將模板RNA與反轉錄引物（RandomPrimers和Oligo(dT)15Primer）的混合物進行70℃、5min預變性，完成后取出置于冰上。第三步：配制RT-Mix，向每個樣品管加入10μl。組分反轉錄混合液終濃度。Nuclease-FreeWater1.6μl。GoScript?5XReactionBuffer4μl1X。MgCl2(25mM)2μl2.5mM。PCRNucleotideMix1μl0.5mM。RecombinantRNasin?RibonucleaseInhibitor0.4μl20units。GoScript?ReverseTranscriptase1μl。第四步：設置反轉錄程序，包括退火、延伸、逆轉錄酶失活三步（退火25℃5min，延伸42℃60min，失活70℃15min，4℃+∞。程序完成本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種與卵巢癌相關的環狀非編碼RNA?PUM1的shRNA，其特征在于，所述的shRNA為shRNA1或shRNA2；針對circPUM1設計shRNA1，所述的shRNA的top?strand和bottom?strand的核苷酸序列分別SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示；針對circPUM1設計的?siRNA2，所述的shRNA的top?strand和bottom?strand的核苷酸序列分別SEQ.ID.NO.4和SEQ.ID.NO.5所示。

【技術特征摘要】
1.一種與卵巢癌相關的環狀非編碼RNA-PUM1的shRNA，其特征在于，所述的shRNA為shRNA1或shRNA2；針對circPUM1設計shRNA1，所述的shRNA的topstrand和bottomstrand的核苷酸序列分別SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示；針對circPUM1設計的siRNA2，所述的shRNA的topstrand和bottomstrand的核苷酸序列分別SEQ.ID.NO.4和SEQ.ID.NO....

【專利技術屬性】
技術研發人員：趙楊，宗志紅，陳說，關雪，
申請(專利權)人：中國醫科大學附屬第一醫院，
類型：發明
國別省市：遼寧,21