一種帶有分子標志物的環狀RNA及其制備方法和應用技術

本發明專利技術涉及一種制備帶有分子標志物的環狀RNA的方法，其包括以下步驟：S1：將表達所述環狀RNA的線性形式RNA的DNA構建體加入體外轉錄體系中，轉錄得到帶有分子標志物并且5’末端為單磷酸基團的線性RNA；S2：將所述線性RNA加入連接體系，使所述線性RNA的5’端和3’端形成3’,5’?磷酸二酯鍵，從而得到所述環狀分子。本發明專利技術還涉及所述環狀RNA在獲得與細胞中所述環狀RNA相互作用的蛋白質中的應用以及獲得該蛋白質的方法。通過使用本發明專利技術的方法制備的環狀RNA與原序列形成的環狀RNA在結構上相似度極高，與蛋白的結合效力跟原序列所形成環狀RNA基本沒有差別，是研究與環狀RNA相互作用的蛋白質的有力工具。

【技術實現步驟摘要】
一種帶有分子標志物的環狀RNA及其制備方法和應用
本專利技術涉及環狀RNA領域，更特別地，涉及一種制備帶有分子標志物的環狀RNA的方法，該方法制備的帶有分子標志物的環狀RNA，所述環狀RNA在獲得與細胞中所述環狀RNA相互作用的蛋白質中的應用以及獲得該蛋白質的方法。
技術介紹
環狀RNA(circularRNAs，circRNAs)是一類廣泛存在于各種生物細胞中、具有調控基因表達功能的非編碼RNA，具有結構穩定和組織特異性表達等特征。近年來，隨著高通量測序技術的廣泛應用，研究者們發現環狀RNA具有保守性的特征。因此，這一類古老且的分子受到了極大的關注。2012年，Salzman團隊發現幾百種與人類基因表達密切相關的環狀RNA；2013年，Jeck團隊在人類成纖維細胞中檢測到了約2.5萬種環狀RNA。相繼有大量關于環狀RNA分子研究的文獻報道，其中，哈佛醫學院Salmena團隊提出了著名的“ceRNA分子調控假說”。該假說認為，ceRNA的生物學功能是通過microRNA應答元件(miRNAresponseelement，MRE)完成的，環狀RNA分子可作為一種“分子海綿”，吸附大量microRNA，進而影響基因的轉錄調控。細胞內幾乎所有分子都不是單獨發揮作用的，需要結合相應的DNA、RNA或蛋白才能發揮正常的生物學功能。近年來，環狀RNA分子與microRNA之間相互作用的研究越來越多，也越來越成熟，但是環狀RNA與蛋白相互作用的研究卻寥寥無幾。究其原因，主要是目前尚缺乏大量獲得帶分子標記的環狀RNA的分子生物學方法。本領域現有技術中，常常直接使用線性分子或通過在兩端加接頭形成環狀分子來研究與環狀RNA相互作用的蛋白質。然而，這樣的分子在結構上與環狀RNA的差異極大，因此，其得到的結果可信度非常低。也有些研究者公開了一些合成環狀RNA的方法，但是，他們的方法往往需要進行復雜的化學處理步驟，從而降低了合成的可靠性，并推高了人工成本和試劑成本。因此，為了深入了解環狀RNA分子，闡明其生物學功能，需要一種簡單低廉的分子生物學方法來合成帶分子標記的環狀RNA。
技術實現思路
為解決以上問題，本專利技術提供了一種制備帶有分子標志物的環狀RNA的方法，其包括以下步驟：S1：將表達所述環狀RNA的線性形式RNA的DNA構建體加入體外轉錄體系中，轉錄得到帶有分子標志物并且5’末端為單磷酸基團的線性RNA；S2：將所述線性RNA加入連接體系，使所述線性RNA的5’端和3’端形成3’,5’-磷酸二酯鍵，從而得到所述環狀分子。優選地，所述體外轉錄體系中包含所述線性RNA的5’端第一個核糖核苷的單磷酸形式，以及所有四種核糖核苷的三磷酸形式，并且所述四種核糖核苷的三磷酸形式中的一種或多種被分子標志物標記，所述核糖核苷單磷酸的濃度高于其對應的核糖核苷三磷酸的濃度。優選地，所述核糖核苷單磷酸的濃度是其所對應的核糖核苷三磷酸濃度的5-15倍。優選地，所述分子標志物是生物素。優選地，所述連接體系中包含RNA連接酶和單鏈引導DNA，所述引導DNA的5’端與所述線性RNA的5’端互補，3’端與所述線性RNA的3’端互補，所述引導DNA的兩端分別與所述線性RNA的5’端和3’端結合，并使所述線性RNA的5’端和3’端分別有0-10個堿基游離。優選地，所述引導DNA的5’端和3’端分別獨立地為8-15nt長，所述引導DNA的3’端與5’端之間無間隔序列，或者有小于等于5nt的間隔序列。本專利技術還提供了上述方法制備的環狀RNA。本專利技術還提供了所述環狀RNA在獲得與細胞中所述環狀RNA相互作用的蛋白質中的應用。本專利技術還提供了一種獲得與細胞中環狀RNA相互作用的蛋白質的方法，其包括以下步驟：S3：將上述環狀RNA作為探針，與細胞裂解液共同孵育，所述環狀RNA跟與其相互作用的蛋白質形成環狀RNA-蛋白復合物；S4：通過所述分子標志物捕獲所述環狀RNA-蛋白復合物；S5：從捕獲的所述環狀RNA-蛋白復合物分離得到所述蛋白質。優選地，所述分子標志物是生物素，并且通過磁珠捕獲所述環狀RNA-蛋白復合物。通過使用本專利技術的方法制備的環狀RNA的序列僅在原序列的5’端多了少數幾個多余的堿基，所形成的環狀RNA與原序列形成的環狀RNA在結構上相似度極高，與蛋白的結合效力跟原序列所形成環狀RNA基本沒有差別。所制備的環狀RNA還帶有分子標記，因此，是研究與環狀RNA相互作用的蛋白質的有力工具。附圖說明圖1為研究環狀RNA以及與其相互作用的蛋白質的流程圖；圖2為guideDNA與線性RNA的結合示意圖；圖3為RNA酶R消化處理后，將RNA在3％變性瓊脂糖凝膠中電泳的電泳圖；圖4為RNA酶R處理的環狀RNA探針經過逆轉錄PCR后，DNA產物在1.5％瓊脂糖凝膠中電泳的電泳圖；圖5為環狀RNA探針進行RNApull-down實驗得到將蛋白洗脫之后在12％變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳后進行考馬斯亮藍染色得到的染色照片。具體實施方式以下結合實例對本專利技術的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本專利技術，并非用于限定本專利技術的范圍。本專利技術以環狀RNA分子hsa_circ_0123777為例來進一步闡述本專利技術的內容，流程如圖1所示。1.hsa_circ_0123777表達載體的構建在circularinteractome網站(http://circinteractome.nia.nih.gov)中找到環狀RNA分子hsa_circ_0123777的編碼序列(SEQIDNO:1)。以人類基因組DNA為模版擴增環狀RNA分子的線性序列。為確保成功構建載體，設計引物時，在引物的5'端加入相應的限制性內切酶酶切位點。本例在前引物中加入HindIII(CCCAAGCTT)酶切位點，在后引物中加入BamHI(CGCGGATCC)酶切位點。擴增成功后用1.5％普通瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收(DNA膠回收試劑盒購買自天根生化科技有限公司，貨號為DP209)，DNA產物放至-20℃保存。如果無法成功擴增環狀RNA分子的線性DNA序列，可以找相應的生物公司合成。將該環狀RNA的線性序列連接到可用于體外轉錄的真核表達載體中，具體方法如下：選用的真核克隆載體為pcDNA3.1(+)-myc-HisC(可進行體外轉錄的真核載體均符合條件)。用內切酶HindIII和BamHI(購自TAKARA公司，HindIII貨號為1060,BamHI貨號為1010)分別對上述DNA產物和pcDNA3.1(+)-myc-HisC空載體進行雙酶切，酶切體系如下：DNA產物酶切體系，總體積30μl：10xQuickCutGreenbuffer3μl，HindIII1.5μl，BamHI1.5μl，DNA產物2μg，余下為ddH2O；pcDNA3.1(+)-myc-HisC空載體雙酶切體系，總體積20μl：10xQuickCutGreenbuffer2μl，BamHI1μl，HindIII1μl，pcDNA3.1(+)空載1μg，余下為ddH2O；充分混勻后，37℃，反應1.5小時，用1.5％普通瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收(DNA膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司，貨號為DP209)，回收結束后測樣品濃度。將上述雙酶切DNA產物連接至pc本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種制備帶有分子標志物的環狀RNA的方法，其特征在于，包括以下步驟：S1：將表達所述環狀RNA的線性形式RNA的DNA構建體加入體外轉錄體系中，轉錄得到帶有分子標志物并且5’末端為單磷酸基團的線性RNA；S2：將所述線性RNA加入連接體系，使所述線性RNA的5’端和3’端形成3’,5’?磷酸二酯鍵，從而得到所述環狀分子。

【技術特征摘要】
1.一種制備帶有分子標志物的環狀RNA的方法，其特征在于，包括以下步驟：S1：將表達所述環狀RNA的線性形式RNA的DNA構建體加入體外轉錄體系中，轉錄得到帶有分子標志物并且5’末端為單磷酸基團的線性RNA；S2：將所述線性RNA加入連接體系，使所述線性RNA的5’端和3’端形成3’,5’-磷酸二酯鍵，從而得到所述環狀分子。2.根據權利要求1所述的制備帶有分子標志物的環狀RNA的方法，其特征在于，所述體外轉錄體系中包含所述線性RNA的5’端第一個核糖核苷的單磷酸形式，以及所有四種核糖核苷的三磷酸形式，并且所述四種核糖核苷的三磷酸形式中的一種或多種被分子標志物標記，所述核糖核苷單磷酸的濃度高于其對應的核糖核苷三磷酸的濃度。3.根據權利要求2所述的制備帶有分子標志物的環狀RNA的方法，其特征在于，所述核糖核苷單磷酸的濃度是其所對應的核糖核苷三磷酸濃度的5-15倍。4.根據權利要求1所述的制備帶有分子標志物的環狀RNA的方法，其特征在于，所述分子標志物是生物素。5.根據權利要求1-4中任一項所述的制備帶有分子標志物的環狀RNA的方法，其特征在于，所述連接體系中包含RNA連接酶和單鏈引導DNA，所述引導DNA的5’端與所述線性RNA的5’...

【專利技術屬性】
技術研發人員：童強松，鄭麗端，楊楓，葉霖，李聃，宋華杰，陳亞俊，李歡歡，
申請(專利權)人：華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院，
類型：發明
國別省市：湖北,42