一種檢測(cè)ADRB1基因單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)的方法及試劑盒技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)ADRB1基因單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)的方法，具體步驟為：1)特異性引物的設(shè)計(jì)：根據(jù)被證實(shí)的ADRB1基因標(biāo)簽單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物、ARMS特異性擴(kuò)增引物、內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增引物、特異性探針、內(nèi)標(biāo)探針；其中，所述特異性探針5'端帶有熒光基團(tuán)、3'端帶有熒光淬滅基團(tuán)；2)獲得待測(cè)樣品基因組DNA；3)熒光定量PCR擴(kuò)增：以待測(cè)標(biāo)本的DNA為模板，用步驟1)所述的特異性擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，并分析檢測(cè)結(jié)果。該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便，能在90分鐘內(nèi)完成檢測(cè)，結(jié)果判讀方法簡(jiǎn)單客觀，便于分析。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種檢測(cè)ADRB1基因單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)的方法及試劑盒
本專利技術(shù)屬于分子生物學(xué)
，具體涉及一種檢測(cè)ADRB1基因單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)的方法及試劑盒。
技術(shù)介紹
高血壓等心血管疾病嚴(yán)重威脅人類健康，是50歲以上中老年人的常發(fā)疾病，具有高患病率、高致殘率和高死亡率的特點(diǎn)。據(jù)保守估計(jì)，我國(guó)高血壓患者人數(shù)超過(guò)了1.6億，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。對(duì)高血壓及其并發(fā)癥的治療已經(jīng)成為全球第三大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。藥物是當(dāng)前和今后相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)治療高血壓及其并發(fā)癥的主要手段。然而，由于患者的生理狀態(tài)(如年齡、性別、種族、肥胖、高血壓、糖尿病等)、環(huán)境危險(xiǎn)因素(如吸煙、飲酒)及遺傳多態(tài)性等導(dǎo)致藥物反應(yīng)(療效和不良反應(yīng))的個(gè)體差異，使得接受藥物治療的患者中約有20％-50％病情未得到良好控制。20多年來(lái)的遺傳藥理學(xué)研究結(jié)果表明其中最重要、最根本的因素是遺傳因素，即藥物代謝酶、轉(zhuǎn)運(yùn)體和受體(藥物作用靶點(diǎn))的基因組多態(tài)性導(dǎo)致了其編碼蛋白的功能改變，進(jìn)一步使血藥濃度和藥物敏感型顯著不同。β1-腎上腺素受體(β1adrenergicreceptor，ADRB1)是介導(dǎo)兒茶酚胺作用的一類組織受體，為G-蛋白偶聯(lián)型受體，參與人體對(duì)血壓的調(diào)節(jié)，其基因的多態(tài)性與高血壓密切相關(guān)。Ser49Gly和Arg389Gly是ADRB1基因上兩個(gè)與心血管疾病相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)，二者均可在體外及體內(nèi)改變受體的活性。其中Ser49Gly的多態(tài)性與高血壓的發(fā)病可能沒(méi)有顯著相關(guān)性，而Arg389Gly位于細(xì)胞內(nèi)羧基端，影響配體介導(dǎo)的腺苷酸環(huán)化酶活性及G蛋白偶聯(lián)功能，進(jìn)而影響心率和血壓。研究表明，Arg389是高血壓的易感基因，基因型為Arg389純合子的人群更易發(fā)展為原發(fā)性高血壓。ADRB1基因的多態(tài)性還與抗高血壓藥物，尤其是在人體內(nèi)的反應(yīng)性密切相關(guān)，這里所說(shuō)的反應(yīng)性包括了藥物的療效和安全性兩個(gè)方面，同種劑量的藥物作用于擁有不同基因型的患者，有的人恰好有效，有的人根本無(wú)效，還有的人會(huì)出現(xiàn)藥物的毒副反應(yīng)。美托洛爾和布新洛兒等β-腎上腺素受體阻滯劑(β-阻滯劑)通過(guò)阻斷交感神經(jīng)活性，減少去甲腎上腺素的釋放，從而降低血壓，已被證實(shí)能夠提高心血管疾病患者的存活率并降低死亡率，是臨床上治療高血壓病最常用的一線藥物，但是治療效果受β1-腎上腺素受體(ADRB1)基因多態(tài)性的影響因而在不同心血管疾病患者中表現(xiàn)出異質(zhì)性。心臟在改變?chǔ)?受體與G蛋白之間分子相互作用中，Arg389比Gly389強(qiáng)3-4倍的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，活力更持久，且對(duì)激動(dòng)劑的反應(yīng)更敏感，因此Arg389Arg基因型高血壓患者可能需要更高劑量的β-阻滯劑才能達(dá)到與Arg389Gly或Gly389Gly基因型患者相同的治療效果。Arg389Arg基因型的患者在接受低劑量的β-阻滯劑比高劑量的增加雙倍的死亡風(fēng)險(xiǎn)，而Gly389攜帶者在接受高劑量或低劑量β-阻滯劑時(shí)在死亡風(fēng)險(xiǎn)上無(wú)明顯差異。Gly49對(duì)激動(dòng)劑具有更強(qiáng)的親和力，在激動(dòng)劑長(zhǎng)期刺激下脫敏效果更明顯，Gly49基因型患者對(duì)β-受體阻滯劑的抑制作用較Ser49基因型患者更為敏感。因此利用基因檢測(cè)技術(shù)對(duì)高血壓患者的ADRB1基因多態(tài)性進(jìn)行解讀，根據(jù)個(gè)體與藥物治療相關(guān)基因的遺傳多樣性制定不同的治療方案，實(shí)現(xiàn)藥物治療個(gè)體化具有重要的臨床意義。根據(jù)檢測(cè)的結(jié)果調(diào)整患者的用藥劑量，既可以使藥物發(fā)揮最佳的療效，最大限度地防止毒副反應(yīng)的發(fā)生，也可以避免藥物的資源浪費(fèi)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
有鑒于此，本專利技術(shù)的目的在于提供一種檢測(cè)ADRB1基因單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)的方法，其能夠簡(jiǎn)捷、直觀、準(zhǔn)確的對(duì)ADRB1基因單核苷酸多態(tài)性基因型進(jìn)行檢測(cè)、分析。為實(shí)現(xiàn)以上目的，本專利技術(shù)的技術(shù)方案為：檢測(cè)ADRB1基因單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)的方法，其具體步驟為：1)特異性引物的設(shè)計(jì)根據(jù)被證實(shí)的ADRB1基因標(biāo)簽單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物、ARMS特異性擴(kuò)增引物、內(nèi)標(biāo)引物、特異性探針、內(nèi)標(biāo)探針；其中，所述特異性探針5'端帶有熒光基團(tuán)、3'端帶有熒光淬滅基團(tuán)；2)獲得待測(cè)樣品基因組DNA3)熒光定量PCR擴(kuò)增以待測(cè)標(biāo)本的DNA為模板，用步驟1)所述的特異性擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，并分析檢測(cè)結(jié)果。進(jìn)一步，所述步驟1)中，所述ADRB1基因標(biāo)簽單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)包括：ADRB1rs1801252和ADRB1rs1801253位點(diǎn)。ADRB1rs1801252位點(diǎn)即為Ser49Gly，又稱為A145G，使編碼的49位絲氨酸被甘氨酸取代(Ser→Gly)。ADRB1rs1801253位點(diǎn)即為Arg389Gly，又稱為G1165C，使編碼的第389位氨基酸由甘氨酸變成精氨酸(Gly→Arg)。內(nèi)標(biāo)引物和內(nèi)邊探針組成內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)。使用內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)該熒光定量PCR反應(yīng)是否存在抑制，由于待檢測(cè)的樣品中的某些成分可能含有導(dǎo)致PCR出現(xiàn)部分或完全抑制。此外，擴(kuò)增儀可能存在高于允許范圍的孔間差，導(dǎo)致不同管間擴(kuò)增效率差異。另外人為加樣錯(cuò)誤也可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。因此本專利技術(shù)在一些具體實(shí)施方案中采用內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)來(lái)消除上述隱患，保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。進(jìn)一步，ADRB1rs1801252位點(diǎn)的上游擴(kuò)增引物的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，下游擴(kuò)增引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；145AARMS特異性擴(kuò)增引物的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，特異性探針的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；145GARMS特異性擴(kuò)增引物的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示，特異性探針的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示；ADRB1rs1801253位點(diǎn)的上游擴(kuò)增引物的核苷酸序列如SEQIDNO：7所示，下游擴(kuò)增引物的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；1165GARMS特異性擴(kuò)增引物的核苷酸序列如SEQIDNO：9所示，特異性探針的核苷酸序列如SEQIDNO：10所示；1165CARMS特異性擴(kuò)增引物的核苷酸序列如SEQIDNO：11所示，特異性探針的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示，內(nèi)標(biāo)正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO：13所示，內(nèi)標(biāo)反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO：14所示，內(nèi)標(biāo)探針的核苷酸序列如SEQIDNO：15所示。詳見(jiàn)下表：4條ARMS特異性擴(kuò)增引物分別在3'端模板堿基與待擴(kuò)增類型的堿基配對(duì)，同時(shí)在其3'末端倒數(shù)第2-3位增加一個(gè)或者兩個(gè)堿基錯(cuò)配，以增強(qiáng)特異性。特異性探針5'端修飾有FAM或VIC，3'端修飾有非熒光淬滅基團(tuán)NFQ，該基團(tuán)本身不產(chǎn)生熒光，因此可以大大降低本底信號(hào)的強(qiáng)度。同時(shí)該特異性探針上還連接有MGB修飾基團(tuán)，可以將該探針的Tm值提高10℃左右。因此同樣的Tm值，MGB探針可以比普通Taqman探針設(shè)計(jì)的更短，使得探針在識(shí)別具有單個(gè)核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)時(shí)特異性更強(qiáng)。內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)針對(duì)人類基因組保守區(qū)域設(shè)計(jì)，具有高度的靈敏性和擴(kuò)增特異性。內(nèi)標(biāo)探針5'端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)，如ROX、FAM、VIC等，3'端標(biāo)記有不發(fā)光熒光淬滅基團(tuán)，如BHQ2等。當(dāng)探針完整的時(shí)候，報(bào)告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，儀器檢測(cè)不到信號(hào)。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在DNA鏈延伸過(guò)程中遇到與模板結(jié)合的探針，其5'→3'外切核酸酶活性就會(huì)將探針切斷，報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)。因此，檢測(cè)到的信號(hào)強(qiáng)度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
檢測(cè)ADRB1基因單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)的方法，其特征在于，具體步驟為：1)特異性引物的設(shè)計(jì)根據(jù)被證實(shí)的ADRB1基因標(biāo)簽單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物、ARMS特異性擴(kuò)增引物、內(nèi)標(biāo)引物、特異性探針、內(nèi)標(biāo)探針；其中，所述特異性探針5'端帶有熒光基團(tuán)、3'端帶有熒光淬滅基團(tuán)；2)獲得待測(cè)樣品基因組DNA3)熒光定量PCR擴(kuò)增以待測(cè)標(biāo)本的DNA為模板，用步驟1)所述的特異性擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，并分析檢測(cè)結(jié)果。

【技術(shù)特征摘要】
1.檢測(cè)ADRB1基因單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)的方法，其特征在于，具體步驟為：1)特異性引物的設(shè)計(jì)根據(jù)被證實(shí)的ADRB1基因標(biāo)簽單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物、ARMS特異性擴(kuò)增引物、內(nèi)標(biāo)引物、特異性探針、內(nèi)標(biāo)探針；其中，所述特異性探針5'端帶有熒光基團(tuán)、3'端帶有熒光淬滅基團(tuán)；2)獲得待測(cè)樣品基因組DNA3)熒光定量PCR擴(kuò)增以待測(cè)標(biāo)本的DNA為模板，用步驟1)所述的特異性擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，并分析檢測(cè)結(jié)果。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)ADRB1基因單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)的方法，其特征在于，所述步驟1)中，所述ADRB1基因標(biāo)簽單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)包括：ADRB1rs1801252和ADRB1rs1801253位點(diǎn)。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)ADRB1基因單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)的方法，其特征在于，ADRB1rs1801252位點(diǎn)的上游擴(kuò)增引物的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，下游擴(kuò)增引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；145AARMS引物的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，特異性探針的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；145GARMS引物的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示，特異性探針的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示；ADRB1rs1801253位點(diǎn)的上游擴(kuò)增引物的核苷酸序列如SEQIDNO：7所示，下游擴(kuò)增引物的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；1165GARMS引物的核苷酸序列如SEQIDNO：9所示，特異性探針的核苷酸序列如SEQIDNO：10所示；1165CARMS引物的核苷酸序列如SEQIDNO：11所示，特異性探針的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示，內(nèi)標(biāo)正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO：13所示，內(nèi)標(biāo)反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO：14所示，內(nèi)標(biāo)探針的核苷酸序列如SEQID...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：不公告發(fā)明人，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：重慶迪威納生物技術(shù)有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：重慶,50