一種提高蘋果轉基因材料再生效率的方法技術

本發明專利技術公開了一種提高蘋果轉基因材料再生效率的方法，包括：圓葉海棠組培苗在擴繁培養基中培養一個月，將莖基部的愈傷用手術刀切下，然后將再生的莖段移植到新的培養基中；再生的莖段在擴繁培養基中培養一個月，取完全伸展的功能葉橫切中脈兩至三刀，農桿菌侵染后轉接到預分化培養基中，暗培養2?4天后轉移到分化培養基中，暗培養2周后光下培養，直至分化出抗性芽；將抗性芽移植到繼代培養基中進一步培養20?30天；挑選株高達到1.5cm的再生植株移植到生根培養基，培養一個月進行移栽。本發明專利技術離體葉片再生效率達到80.33％，擴繁系數達到8.2，生根率達到96.38％。

Method for improving regeneration efficiency of Apple genetically modified material

The invention discloses a method to improve the efficiency of regeneration of transgenic materials including: Apple round Ye Haitang Plantlets in the propagation of a month culture medium, will stem callus with a knife cut, and then the regeneration of stem transplantation to the new medium; stem regeneration in the propagation of culture one month culture medium, the full extension of the two to three leaf midrib crosscut knife, Agrobacterium infection after transfer to pre differentiation culture medium and cultured in darkness for 2 4 days after transfer to the differentiation medium, cultured in darkness for 2 weeks after training, until the differentiation of resistant buds; the resistant buds were transplanted to subculture medium culture for a further 20 30 days; selected plantlets transplantation up to 1.5cm in rooting medium, cultivating a month for transplanting. The regeneration efficiency can reach 80.33% and the propagation coefficient reached 8.2, the rooting rate reached 96.38%.

【技術實現步驟摘要】
一種提高蘋果轉基因材料再生效率的方法
本專利技術屬于蘋果種植
，尤其涉及一種提高蘋果轉基因材料再生效率的方法。
技術介紹
近年來，基因工程的發展為蘋果品種的遺傳改良提供了新的技術方法，拓寬了基因源，突破了種間界限，能從動植物及微生物中分離各種功能基因用于遺傳改良，縮短育種周期，提高育種效率，為蘋果遺傳育種研究及利用各種遺傳種質資源開辟了一條新的技術途徑。國外早在1991年就成功應用icp基因轉化蘋果，1992美國批準將攜帶由icp基因的轉基因蘋果植株進行田間試驗；國內達克東等也應用cpti基因轉化了皇家嘎拉。受基因的控制，有些蘋果砧木在扦插和壓條繁殖時，生根極為困難，為了提高M26砧木生根能力，lamber等將來自發根農桿菌ri質粒的T-DNA區導入M26中，結果攜帶有ri質粒的T-DNA的轉化植株有良好的根系，生根能力大大提高。蘋果愈傷組織再生植株尚存在較大困難，葉片再生胚狀體還不夠成熟且周期較長，所以，探索適用于蘋果遺傳轉化的新材料是蘋果育種工作者亟待解決的問題之一。綜上所述，現有蘋果轉基因材料大部分是皇家嘎啦和M26，由于其他材料的再生體系不成熟，尚未廣泛推廣應用，轉基因材料相對單一，另一方面，蘋果葉片再生能力差，再生植株的效率比較低。尋求一種再生效率高的蘋果轉基因材料是蘋果育種工作者亟待解決的問題之一。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種提高蘋果轉基因材料再生效率的方法，旨在解決現有使用的蘋果轉基因材料是皇家嘎啦和M26，轉基因材料單一，葉片再生植株的效率較低的問題。本專利技術是這樣實現的，一種提高蘋果轉基因材料再生效率的方法，所述提高蘋果轉基因材料再生效率的方法包括以下步驟：步驟一，圓葉海棠組培苗在擴繁培養基中培養一個月，將莖基部的愈傷用手術刀切下，然后將再生的莖段移植到繼代培養基中；步驟二，再生的莖段在擴繁培養基中培養一個月，取完全伸展的功能葉橫切中脈兩至三刀，農桿菌侵染后轉接到預分化培養基中，培養2-4天后轉移到分化培養基中暗培養2周后光下培養，直至長出抗性芽，期間可以更換培養基；步驟三，將抗性芽移植到繼代培養基中進一步培養20-30天；步驟四，挑選株高達到1.5cm的再生植株移植到生根培養基，培養一個月作用進行移栽。進一步，所述步驟一和步驟三光下培養的條件光照16h/d、光照2000lux，溫度為25℃，平均濕度為70–80％。進一步，所述繼代培養基為MS培養基，由IBA0.1mg/L，6-BA0.6mg/L，瓊脂8g/L和蔗糖30g/L組成，pH為5.8。進一步，所述預分化培養基由MS培養基、2.0mg/LN-苯基-N-1,2,3-噻二唑-5-脲、0.2mg/L吲哚丁酸、瓊脂8g/L和蔗糖30g/L組成，pH為5.8。進一步，所述分化培養基為MS培養基，由2.0mg/LN-苯基-N-1,2,3-噻二唑-5-脲、0.2mg/L吲哚丁酸、200mg/L頭孢霉素、50mg/L卡那霉素、瓊脂8g/L和蔗糖30g/L組成，pH為5.8。進一步，所述生根培養基為1/2MS培養基，由IBA0.9mg/L組成，pH為5.8。本專利技術的另一目的在于提供一種利用所述提高蘋果轉基因材料再生效率的方法種植的蘋果。本專利技術提供的提高蘋果轉基因材料再生效率的方法，圓葉海棠是蘋果苗木最常用的一種基砧，其顯著特點是硬枝可扦插繁育、抗逆性強、嫁接親和力好根系發達，成活率90％以上，具有抗冷、抗旱、抗鹽堿、抗病蟲等優良性狀，提高圓葉海棠的再生效率對于實際生產也具有十分重要的作用，圓葉海棠再生體系的建立有利于提高蘋果轉基因的轉化效率。本專利技術能夠提高蘋果轉基因效率，解決蘋果轉基因轉化效率低的問題，為鑒定基因功能奠定基礎，此材料并對指導實際生產具有十分重要的意義；此材料離體葉片再生效率達到80.33％，擴繁系數達到8.2，生根率達到96.38％。附圖說明圖1是本專利技術實施例提供的提高蘋果轉基因材料再生效率的方法流程圖。具體實施方式為了使本專利技術的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本專利技術進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本專利技術，并不用于限定本專利技術。下面結合附圖對本專利技術的應用原理作詳細的描述。如圖1所示，本專利技術實施例提供的提高蘋果轉基因材料再生效率的方法包括以下步驟：S101：圓葉海棠組培苗在擴繁培養基中培養一個月，將莖基部的愈傷用手術刀切下，然后將再生的莖段移植到新的培養基中；S102：再生的莖段在擴繁培養基中培養一個月，取完全伸展的功能葉橫切中脈兩至三刀，農桿菌侵染后轉接到預分化培養基中，培養2-4天后轉移到分化培養基中，暗培養2周后光下培養，直至長出抗性芽；S103：將抗性芽移植到繼代培養基中進一步培養20-30天；S104：挑選株高達到1.5cm的再生植株移植到生根培養基，培養一個月作用進行移栽。所述組培室光照16h/d、光照2000lux，溫度為25℃，平均濕度為70–80％。所述預分化培養基配方：MS培養基，2.0mg/LN-苯基-N-1,2,3-噻二唑-5-脲,0.2mg/L吲哚丁酸，瓊脂8g/L，蔗糖30g/L，pH為5.8；分化培養基配方MS培養基，2.0mg/LN-苯基-N-1,2,3-噻二唑-5-脲,0.2mg/L吲哚丁酸，200mg/L頭孢霉素，50mg/L卡那霉素，瓊脂8g/L,蔗糖30g/L，pH為5.8；繼代培養基配方：MS培養基，IBA0.1mg/L，6-BA0.6mg/L，瓊脂8g/L,蔗糖30g/L，pH為5.8；生根培養基配方：1/2MS培養基，IBA0.9mg/L，pH為5.8。表1圓葉海棠擴繁系數和再生率統計表擴繁系數計算公式為：經過一個繼代周期的培養后，每一棵圓葉海棠組培苗能穩定地轉接多少棵的數目。再生率計算公式為：(已分化的外植體數/接種外植體總數)×100。表2圓葉海棠生根率、根數目、根長度和根生物量統計生根率計算公式為：(生根的組培苗數/全部的組培苗數)×100。根長度使用直尺測量。根生物量計算公式：根長度×根數目。圓葉海棠是蘋果苗木最常用的一種基砧，其顯著特點是硬枝可扦插繁育、抗逆性強、嫁接親和力好根系發達，成活率90％以上，具有抗冷、抗旱、抗鹽堿、抗病蟲等優良性狀，提高圓葉海棠的再生效率對于實際生產也具有十分重要的作用，圓葉海棠再生體系的建立有利于提高蘋果轉基因的轉化效率，此專利技術將為基因功能鑒定奠定良好的基礎。以上所述僅為本專利技術的較佳實施例而已，并不用以限制本專利技術，凡在本專利技術的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本專利技術的保護范圍之內。本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種提高蘋果轉基因材料再生效率的方法，其特征在于，所述提高蘋果轉基因材料再生效率的方法包括以下步驟：步驟一，圓葉海棠組培苗在擴繁培養基中培養一個月，將莖基部的愈傷用手術刀切下，然后將再生的莖段移植到新的繼代培養基中；步驟二，再生的莖段在擴繁培養基中培養一個月，取完全伸展的功能葉橫切中脈兩至三刀，農桿菌侵染后轉接到預分化培養基中，培養2?4天后轉移到分化培養基中，暗培養2周后光下培養，直至長出抗性芽，期間可以更換培養基；步驟三，將抗性芽移植到繼代培養基中進一步培養20?30天；步驟四，挑選株高達到1.5cm的再生植株移植到生根培養基，培養一個月左右進行移栽。

【技術特征摘要】
1.一種提高蘋果轉基因材料再生效率的方法，其特征在于，所述提高蘋果轉基因材料再生效率的方法包括以下步驟：步驟一，圓葉海棠組培苗在擴繁培養基中培養一個月，將莖基部的愈傷用手術刀切下，然后將再生的莖段移植到新的繼代培養基中；步驟二，再生的莖段在擴繁培養基中培養一個月，取完全伸展的功能葉橫切中脈兩至三刀，農桿菌侵染后轉接到預分化培養基中，培養2-4天后轉移到分化培養基中，暗培養2周后光下培養，直至長出抗性芽，期間可以更換培養基；步驟三，將抗性芽移植到繼代培養基中進一步培養20-30天；步驟四，挑選株高達到1.5cm的再生植株移植到生根培養基，培養一個月左右進行移栽。2.如權利要求1所述的提高蘋果轉基因材料再生效率的方法，其特征在于，所述步驟一和步驟三光下培養的條件光照16h/d、光照2000lux，溫度為25℃，平均濕度為70–80％。3.如權利要求1所述的提高蘋果轉基因材料再生效率的方法，其特征在于，所述繼代培養基為...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張東，毛江萍，韓明玉，李珂，宋春暉，劉禎，
申請(專利權)人：西北農林科技大學，
類型：發明
國別省市：陜西,61