一種長喙毛茛澤瀉微繁方法技術

本發明專利技術涉及一種長喙毛茛澤瀉微繁方法，屬于園藝林業技術領域。將清洗后的長喙毛茛澤瀉作為外植體進行滅菌得到無菌苗，在無菌苗上選取微繁器官進行生根培養，得到的組培苗移栽即可。將發明專利技術應用于長喙毛茛澤瀉的培養，具有培養快、成活率高等優點。

Method for micropropagation of long beaked Buttercup

The invention relates to a method for micropropagation of a long beaked Buttercup, belonging to the technical field of horticulture and forestry. After cleaning the long beak, Ranunculus and Alisma as explants, sterilized seedlings were obtained, and the micropropagation organs were selected for rooting culture. The plantlets were transplanted. The invention has the advantages of fast culture and high survival rate.

【技術實現步驟摘要】
一種長喙毛茛澤瀉微繁方法
本專利技術涉及一種長喙毛茛澤瀉微繁方法，屬于園藝林業

技術介紹
長喙毛茛澤瀉(Ranalismarostratum)是一種瀕危的水生草本植物，隸屬澤瀉科毛茛澤瀉屬，產于我國浙江、江西、湖南及越南和馬來西亞，國內目前只在江西、湖南發現了零散的小群居，而且群居數目和個體仍在減小，說明這種植物已處于嚴重的瀕危狀態。目前，關于長喙毛茛澤瀉的組織工程育苗鮮有報道。而如何擴大其種群數量，并對該植物進行保護，是迫切解決的問題。基于此，做出本申請。
技術實現思路
針對現有長喙毛茛澤瀉的現狀，本申請提供一種可實現無性人工繁殖、成活率高的長喙毛茛澤瀉微繁方法。為實現上述目的，本申請采取的技術方案如下：一種長喙毛茛澤瀉微繁方法，將清洗后的長喙毛茛澤瀉作為外植體進行滅菌得到無菌苗，在無菌苗上選取微繁器官進行生根培養，得到的組培苗移栽即可。進一步的，作為優選：所述的微繁器官為無菌苗的莖段、葉片或葉柄，該微繁器官進行芽誘導后再進行生根培養。更優選的，所述的莖段選用帶有分生組織的莖段。所述的誘導培養基是由MS培養基和6BA(6-芐氨基嘌呤)、KT(激動素)、IBA(吲哚丁酸)、ZT(玉米素)中的至少兩種構成，6BA、KT、IBA、ZT中的至少兩種添加在MS培養基中；所述6BA的添加濃度為0.2-4mg/L，所述KT的添加濃度為0.2-2mg/L，所述IBA的添加濃度為0.4-1mg/L，所述ZT的添加濃度為0.2-1mg/L。所述的微繁器官為無菌苗的匍匐莖，該匍匐莖直接生芽繁殖得到組培苗。所述的無菌苗培養基是由MS培養基和特美汀和/或頭孢霉素，特美汀和/或頭孢霉素添加在MS培養基中。更優選的，所述的MS培養基先滅菌后再添加特美汀和/或頭孢霉素。所述的生根培養基為未添加激素的MS培養基。所述的MS培養基的pH為5.8-6.0，其化學成分及用量如下(工作液濃度單位：mg/L)：大量元素：NH4NO3(1650)，KNO3(1900)，CaCl2·2H2O(440)，MgSO4·7H2O(370)，KH2PO4(170)；微量元素：KI(0.83)，H3BO3(6.2)，MnSO4·4H2O(22.3)，ZnSO4·7H2O(8.6)，Na2MoO4·2H2O(0.25)，CuSO4·5H2O(0.025)，CoCl2·6H2O(0.025)；鐵鹽：FeSO4·7H2O(27.8)，Na2-EDTA·2H2O(37.3)；有機物質：肌醇(100)，煙酸(0.5)，鹽酸吡哆醇(維生素B6)(0.5)，鹽酸硫胺素(維生素B1)(0.1)，甘氨酸(2.0)。所述的MS培養基中添加有瓊脂，瓊脂的添加濃度為5.4-5.8g/L。附圖說明圖1為本申請中長喙毛茛澤瀉外植體接種6天的狀態圖；圖2為本申請中外植體培育30天時得到的無菌苗側面圖；圖3為本申請中外植體培育30天時得到的無菌苗俯視圖；圖4為圖3中的無菌苗單株；圖5為圖3中的無菌苗纖匍枝；圖6為本申請中長喙毛茛澤瀉葉片培育20天時的狀態圖；圖7為本申請中長喙毛茛澤瀉葉柄培育20天時的狀態圖；圖8為本申請中長喙毛茛澤瀉帶分生組織的莖段誘導30天時的狀態圖(培養基：MS+6BA2.0mg/L+KT2.0mg/L+IBA0.4mg/L)；圖9為圖8中誘導培養得到的單株狀態圖(箭頭指示不定芽)；圖10為生根狀態圖(即圖8的仰視圖)；圖11為移栽效果圖。具體實施方式1.材料與方法1.1實驗材料長喙毛茛澤瀉幼苗由浙江林業科學院石從廣博士提供，本實驗室人工氣候室培養，實驗材料采用該植物的葉片、葉柄和帶有分生組織的莖段。1.2培養基與培養條件1.2.1MS培養基配方MS培養基作為基本培養基，其化學成分及用量如下(工作液濃度單位：mg/L)：大量元素：NH4NO3(1650)，KNO3(1900)，CaCl2·2H2O(440)，MgSO4·7H2O(370)，KH2PO4(170)；微量元素：KI(0.83)，H3BO3(6.2)，MnSO4·4H2O(22.3)，ZnSO4·7H2O(8.6)，Na2MoO4·2H2O(0.25)，CuSO4·5H2O(0.025)，CoCl2·6H2O(0.025)；鐵鹽：FeSO4·7H2O(27.8)，Na2-EDTA·2H2O(37.3)；有機物質：肌醇(100)，煙酸(0.5)，鹽酸吡哆醇(維生素B6)(0.5)，鹽酸硫胺素(維生素B1)(0.1)，甘氨酸(2.0)。1.2.2抗生素培養基/無菌苗培養基可選用三種作為比對案例：(1)MS+特美汀200mg/L(單位下同)+頭孢霉素200；(2)MS+特美汀200；(3)MS+頭孢霉素400。1.2.3芽誘導培養基可選用十種作為比對案例：(4)MS+6BA2.0mg/L(單位下同)+KT2.0+IBA0.4；(5)MS+6BA4.0+KT2.0+IBA0.4；(6)MS+KT4.0+IBA0.4；(7)MS+ZT0.2+6BA2.0+KT2.0+IBA0.4；(8)MS+ZT0.4+IBA0.4；(9)MS+ZT1.0+IBA0.4；(10)MS+ZT0.2+KT2.0+IBA0.4；(11)MS+ZT0.2+6BA2.0+IBA0.4；(12)MS+ZT0.2+IBA1.0；(13)MS+6BA0.2+KT0.2+IBA1.0。1.2.4生根培養基：未加激素的MS培養基。上述所有MS培養基中都添加蔗糖30g/L，pH值5.8-6.0；由于長喙毛茛澤瀉是沼澤植物，我們通過控制瓊脂添加濃度進行培養基硬度的調整，本實施例以分三個檔次的瓊脂濃度為例，分別是：5.4g/L的軟培養基，強度：1000；5.6g/L的正常培養基；5.8g/L的硬培養基；培養基滅菌條件：115℃，15min，培養基滅完菌后，冷至60℃添加特美汀、頭孢霉素等抗生素。1.2.5培養條件組織培養室與人工氣候室內的溫度為25±2℃；光照周期為14小時光照/10小時黑暗，光照強度為2000-2500lux。表1不同激素組合對莖段不定芽的誘導表1中的編號是指培養基的編號，表1中的各參數均為接種20天統計，每個組合統計21塊外植體，采用t-test方法檢測差異度，設定每個外植體有1個不定芽為參照；“*”代表p<0.05，“**”代表p<0.01。1.3方法本申請的微繁過程具體如下：1.3.1外植體滅菌和無菌苗的培養：長喙毛茛澤瀉去除淤泥、老的根和葉，用自來水沖洗兩小時，濃洗潔精溶液浸泡5分鐘，不斷震蕩，清水沖洗掉洗潔精后移入超凈工作臺。外植體用升汞(0.1％)消毒8分鐘，無菌水清洗5分鐘(重復四次)，無菌水沖洗三次，除凈升汞。然后將帶有嫩葉的莖段移入3種添加不同抗生素的培養基中，一周后判斷除菌的效果。然后每2周更換新的培養基，3次后移入無抗生素的MS培養集中，一周后判斷除菌的效果。1.3.2芽誘導培養：超凈工作臺中，無菌苗的葉切成0.5cmx0.5cm長度的葉盤，葉柄切成0.5cm長度的葉柄段，帶有分生組織的莖縱切0.2cm-0.4cm直徑的莖段，把這些莖段移入芽誘導培養基中，組織培養室中培養。20-30天統計芽誘導的情況。1.3.3生根培養：芽長到1.5-3cm時，把芽切下來移入未加激素的MS培養基中生根。1本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種長喙毛茛澤瀉微繁方法，其特征在于：將清洗后的長喙毛茛澤瀉作為外植體進行滅菌培養得到無菌苗，在無菌苗上選取微繁器官進行生根培養，得到的組培苗移栽即可。

【技術特征摘要】
1.一種長喙毛茛澤瀉微繁方法，其特征在于：將清洗后的長喙毛茛澤瀉作為外植體進行滅菌培養得到無菌苗，在無菌苗上選取微繁器官進行生根培養，得到的組培苗移栽即可。2.如權利要求1所述的一種長喙毛茛澤瀉微繁方法，其特征在于：所述的微繁器官為無菌苗的匍匐莖，該匍匐莖直接生芽繁殖得到組培苗。3.如權利要求1所述的一種長喙毛茛澤瀉微繁方法，其特征在于：所述的微繁器官為無菌苗的莖段、葉片或葉柄，無菌苗的莖段、葉片或葉柄進行芽誘導后再進行生根培養。4.如權利要求3所述的一種長喙毛茛澤瀉微繁方法，其特征在于：所述的莖段選用帶有分生組織的莖段。5.如權利要求3所述的一種長喙毛茛澤瀉微繁方法，其特征在于：所述的誘導培養基是由MS培養基和6BA、KT、IBA、ZT中的至少兩種構成，6BA、KT、IBA、ZT中的至少兩種添加在MS培養基中。6.如權利要求5所述的一種長喙毛茛澤瀉微繁方法，其特征在于：所述6BA的添加濃度為0.2-4mg/L，所述KT的添加濃度為0.2-2mg/L，所述IBA的添加濃度為0.4-1mg/L，所述ZT的添加濃度為0.2-1mg/L。7.如權利要求1所述的一種長喙毛茛澤瀉微繁方法，其特征在于：所述的無菌苗培養基是由MS培養基...

【專利技術屬性】
技術研發人員：郭萬里，楊佳瑤，梁宗鎖，石從廣，向倩倩，楊宗岐，祁哲晨，丁先鋒，
申請(專利權)人：浙江理工大學，
類型：發明
國別省市：浙江,33