一種納米磁球定向比例可控固定多酶的方法技術

一種納米磁球定向比例可控固定多酶的方法屬于酶固定化技術領域。該方法以螯合鎳離子的納米磁球為載體，以融合了錨定域的熒光蛋白(GFP和DsRed)為模型代替融合了錨定域的酶，利用基因重組構建的包含N端His標簽和黏連蛋白(A和C)的支架蛋白為中介，通過Ni

Nano magnetic ball directional proportional controllable enzyme fixing method

The invention relates to a nano magnetic ball directional proportional controllable enzyme fixing method, belonging to the field of enzyme immobilization technology. In this method, nano magnetic sphere nickel chelate ion as the carrier, with the fusion of fluorescent protein anchoring domain (GFP and DsRed) for the model to replace the fusion of anchoring domain of the enzyme, constructed by gene recombination including N His tags and laminin (A and C) scaffold protein mediated by Ni

【技術實現步驟摘要】
一種納米磁球定向比例可控固定多酶的方法
本專利技術屬于酶固定化
，具體地涉及一種多酶的固定化方法，尤其涉及一種用于酶級聯反應中需要兩種不同比例的酶催化反應的多酶固定化方法。
技術介紹
酶是一種能夠降低反應的活化能并提高反應速率的生物催化劑。固定化酶具有顯著的催化性能和可重復利用性，因而，其在綠色應用和可持續(xù)應用中具有巨大的潛力，特別是在工業(yè)應用中表現尤為明顯。現在已經有很多關于努力開發(fā)有效的固定酶的策略的報道，其中大多數主要集中在單一酶的固定化。然而，在許多情況下，單個酶不能完全催化反應，而是需要多個酶在級聯反應中協同作用，因此越來越多的人開始對通過多酶共固定來催化生物轉化感興趣。將多酶在載體表面進行共固定,充分地利用不同酶種的催化特性,提高中間產物的運轉濃度,既能擴展酶催化的應用范圍,又可以提升多酶體系的整體反應效率,在很大程度上克服了單酶反應體系單一催化的局限性。雖然已經開始有人探索用于共固定多酶的不同策略，但其中大多數方法仍是基于單一酶固定化開發(fā)的技術。通常，這些方法的主要缺點是難以在共固定期間將一種酶與另一種酶區(qū)分開，因為很多酶具有共同的結構特征。因此，共定位的酶分子的順序和化學計量比通常不能很好地控制，從而導致級聯反應總催化效率的降低。與體外反應系統相比，活細胞中或活細胞表面的許多級聯反應由多酶復合物催化，多酶復合物即由不同的酶自組裝成高度有序的結構。這種多酶復合物的優(yōu)點包括產生底物通道的物理鄰近效應，保持中間體的高局部濃度，減少底物抑制作用，從而提高目標途徑的總體催化效率。而對于固定酶的載體，大部分磁性高分子微球是把磁性金屬或氧化物與有機高分子復合的有機.無機雜化材料，是把具有磁性的金屬或金屬氧化物這些無機物材料與有機高分子雜化、復合而產生的。磁性復合高分子微球的高分子部分還可以很方便的通過共聚、與小分子通過共價鍵鍵合、吸附等方法引入功能基團從而為其他有機或無機納米材料引入磁性高分子微球提供方便，以進一步實現新的功能。而納米磁球是20世紀70年代后逐步產生、發(fā)展、壯大的一種應用前景廣闊的新型磁性材料,由于其具有良好的磁響應性、粒徑小、比表面積大、生物相容性好等優(yōu)點而廣泛地應用于固定化酶技術中。
技術實現思路
本專利技術旨在提供一種納米磁球定向比例可控固定多酶的方法，該方法操作簡單，條件溫和，能夠實現在納米磁球上定向和比例可控地固定多酶，大大提高了需要多酶的級聯反應的催化效率；同時用磁性納米微球作為載體，有利于酶和底物、產物的分離和重復性利用。為了實現上述目的，本專利技術具體技術方案如下：1.一種納米磁球定向比例可控固定多酶的方法，其特征在于：利用納米磁球表面螯合的Ni2+和支架蛋白的His標簽之間的親和吸附作用，把支架蛋白固定在納米磁球上；依據支架蛋白上黏連蛋白和錨定域的特異性吸附作用，將融合了錨定域的酶固定在支架蛋白上；通過控制支架蛋白上黏連蛋白的種類、數量和排序，實現酶的定向、比例可控吸附。2.所述的納米磁球定向比例可控固定多酶的方法，用于需要不同數量比的多酶的級聯反應中。3.進一步，所述的納米磁球定向比例可控固定多酶的方法，其特征在于：包括以下步驟：(1)構建重組支架蛋白；(2)構建融合錨定域的熒光蛋白；(3)將支架蛋白和螯合Ni2+的磁球混合培養(yǎng)，使支架蛋白固定在磁球上；(4)將支架蛋白處理過的納米磁球用磁鐵分離，之后和融合了錨定域的熒光蛋白混合吸附，加入CaCl2,使其終濃度為5mM～10mM，使熒光蛋白復合物和支架蛋白結合起來，從而固定在納米磁球上。4.進一步，步驟(1)中所述的支架蛋白包含His標簽。5.進一步，步驟(1)中所述的支架蛋白為包含多個、多種黏連蛋白的不同組合。6.進一步，步驟(2)中所述的每種熒光蛋白分別與一種錨定域結合，這些錨定域分別和步驟(1)中所述的支架蛋白的黏連蛋白特異性結合。7.進一步，步驟(3)中所述的支架蛋白是單一的一種支架蛋白，或者是多種支架蛋白按照不同的摩爾比例混合吸附。8.進一步，步驟(4)中所述的熒光蛋白復合物是粗提液或者純的蛋白溶液。一種納米磁球定向比例可控固定多酶的方法，其特征在于：以螯合了Ni2+的磁性納米微球為載體，融合了錨定域的熒光蛋白為模型蛋白代替酶研究固定化效果，以包含His標簽和黏連蛋白的支架蛋白為中間體通過Ni2+和His標簽的親和吸附作用以及黏連域-錨定域的特異性吸附作用，將融合了錨定域的熒光蛋白固定在納米磁球上。一種納米磁球定向比例可控固定多酶的方法，其特征在于：包括以下步驟：(1)通過基因重組構建的方法，構建支架蛋白ACA和CAC。將A和C克隆到質粒pYD1中，再將融合的ACA和CAC克隆到質粒pETDuet-1中，從而得到N端帶His標簽的支架蛋白pETDuet1-A-C-A和pETDuet1-C-A-C。其中，黏連蛋白A來自C.cellulovorans中的CbpA，黏連蛋白C來自Clostridiumcellulolyticum中CipC的第一個黏連蛋白。(2)通過基因重組構建的方法，構建融合了錨定域的熒光蛋白GFP-docA和DsRed-docC。將GFP和docA插入質粒pYD1中，得到中間帶有GSlinker的GFP-docA(GA)，再將其克隆到質粒pET22b中，用同樣的方法可得到DsRed-docC(RC)。其中，錨定域docA來自C.cellulovorans中的EngY，錨定域docC來自C.cellulolyticum中的celCCA。(3)將支架蛋白于37℃搖床中培養(yǎng)約2h，至OD600＝0.6～0.8，在37℃用1mM的IPTG誘導3h～6h，優(yōu)化為3h；將熒光蛋白復合物于37℃搖床中培養(yǎng)約2h，至OD600＝0.6～0.8，在20℃用0.4mM的IPTG誘導12h。將得到的蛋白溶液在8000r離心5min，并水洗一遍。將得到的菌體重懸在1×PBS緩沖液中(pH≈7.4)，使OD600＝40。用超聲破碎儀破胞，12000r離心10min得上清，即目標蛋白粗提液。(4)進行SDS-PAGE定性表征，用考馬斯亮藍法測蛋白含量，用BandScan軟件測定目標蛋白占蛋白粗提液的百分數，從而計算出目標蛋白的濃度。(5)將螯合了Ni2+的磁性納米微球(MNPs)分散為10mg/ml的溶液，取200ulMNPs重懸在4ml支架蛋白溶液中，15℃搖床培養(yǎng)3～5h。(6)將支架蛋白處理過的納米磁球用磁鐵分離并用水沖洗一遍后和1.2ml融合了錨定域的熒光蛋白在4℃靜置12h，并且加入CaCl2,使其濃度為10mM。(7)根據熒光蛋白的濃度和相應的熒光強度作標準曲線，根據支架蛋白處理過的磁球吸附熒光蛋白前后，熒光蛋白上清溶液的熒光強度差值，計算單位磁球吸附熒光蛋白的量。步驟(5)中，所述支架蛋白可以為單一的一種支架蛋白，也可以為兩種支架蛋白以不同的比例混合。與現有技術相比，本專利技術的有益效果：在本專利技術中，采用了兩種重組支架蛋白，兩者都有三個黏合域和一個N端His標簽。GFP和DsRed基因在C端和錨定域融合，確保他們可以通過黏合域-錨定域的特異性吸附作用和支架蛋白結合。據報道，這種蛋白質-蛋白質相互作用是物種特異性的，因此我們能夠控制GFP和DsRed特異性結合在支架蛋白上的數量和位置。支架蛋白的His標簽通本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種納米磁球定向比例可控固定多酶的方法，其特征在于：利用納米磁球表面螯合的Ni

【技術特征摘要】
1.一種納米磁球定向比例可控固定多酶的方法，其特征在于：利用納米磁球表面螯合的Ni2+和支架蛋白的His標簽之間的親和吸附作用，把支架蛋白固定在納米磁球上；依據支架蛋白上黏連蛋白和錨定域的特異性吸附作用，將融合了錨定域的酶固定在支架蛋白上；通過控制支架蛋白上黏連蛋白的種類、數量和排序，實現酶的定向、比例可控吸附。2.根據權利要求1所述的納米磁球定向比例可控固定多酶的方法，其特征在于：用于需要不同數量比的多酶的級聯反應中。3.根據權利要求1所述的納米磁球定向比例可控固定多酶的方法，其特征在于：包括以下步驟：(1)構建重組支架蛋白；(2)構建融合錨定域的熒光蛋白；(3)將支架蛋白和螯合Ni2+的磁球混合培養(yǎng)，使支架蛋白固定在磁球上；(4)將支架蛋白處理過的納米磁球用磁鐵分離，之后和融合了錨定域的熒光蛋白混合吸附，加入CaCl2,使其終濃度為5mM～10mM，使熒光蛋白復...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：范立海，岳藝，黎梅，陸洋陽，譚天偉，
申請(專利權)人：北京化工大學，
類型：發(fā)明
國別省市：北京,11