一種規模化質粒純化的聯合液相層析分離方法技術

本發明專利技術提供可用于藥物級核酸pDNA疫苗規?；苽涞馁|粒純化方法，該方法聯合應用顆粒介質柱液相層析分離系統與近年開發的固定整體(Monoliths)柱液相層析分離系統，取長補短充分發揮二者的優點獲得了優異效果，具有優良的實用價值。

Combined liquid chromatography separation method for large-scale plasmid purification

The invention provides a method for purification of plasmid DNA vaccine pDNA pharmaceutical grade scale preparation, the method of combined application of granular medium column liquid chromatography system with fixed overall development (Monoliths) column liquid chromatography separation system, give full play to the advantage of the two complement each other to obtain the outstanding effect, has good practical value.

【技術實現步驟摘要】
一種規?；|粒純化的聯合液相層析分離方法
本專利技術涉及生物醫藥領域，具體涉及基因疫苗、基因治療所用質粒的純化分離工藝，更具體地說，涉及規模化質粒純化的聯合液相層析分離方法。技術背景質粒(pDNA)核酸疫苗是正在開發的新型疫苗，具有誘導機體產生細胞免疫應答的優點，對于治療目前沒有有效疫苗的慢性乙型肝炎、艾滋病、結核病、癌癥等需要誘導細胞免疫力的疾病具有良好應用前景，質粒純化技術也從實驗室階段向實用產業化階段發展。質粒是大腸桿菌細胞內能獨立于染色體進行復制和表達的環形DNA。工程質粒是將大腸桿菌質粒經基因工程改造，在其中插入了編碼病原體保護性抗原蛋白的編碼基因，和/或優選的免疫增強性細胞因子編碼基因等。將純化的工程質粒注射入人體肌肉等部位，能在相關抗原加工處理細胞(AntigenPresentCell,APC)或肌肉細胞中表達所編碼的抗原,誘導機體產生體液和細胞免疫應答反應來抵御消滅病原體和癌細胞。迄今較好而實用的質粒純化方法的發展主要有：1)采用Qiagen公司首先提出的硅膠吸附法質粒提取試劑盒進行純化，該方法必須采用得自牛胰腺的牛RNAse酶和能專一結合內毒素將其除去的化學試劑，主要用于實驗室研究的小量質粒提取或獸用核酸疫苗的制備[1]；2)由美國通用(GE)公司(原安瑪西亞Amersham-Pharmarcia)創立并于2003-2005年逐步完善的顆粒介質中壓液相多步(瓊脂糖凝膠過濾+疏水層析+陰離子交換)層析分離法；和3)近年由歐洲BIA公司(總部位于奧地利的BIASeparations公司)創立推出的氯化鈣沉淀+整體柱二步(陰離子交換+疏水層析)中壓液相層析分離法。后兩種方法不用牛RNAse酶和可能有毒的化學試劑，而細菌內毒素基本上不結合這類介質，可在多步層析分離過程中被逐步洗滌去除無須專門處理，從而適合于規模化藥物級核酸疫苗的制備，但這兩種方法各有自己的優點和缺點，詳述于下。目前，液相層析分離介質的基質材料可分為二大類，一類是已運用多年的顆?；蚨嗫最w粒分散園球狀瓊脂糖基質，如美國通用(GE)公司使用的，以及后續改進的理化穩定性和剛性更強的高度交聯瓊脂糖基質系統材料，它們具有更高的分離效率，更好的穩定性和更快的流速；另一類是固定相整體柱(Monoliths)層析分離基質系統CIM(ConvectiveInteractionMedia，對流性相互作用介質)材料。Monoliths為單一連續整體結構，是以大量緊密相聯的均一孔徑(1.2-1.5微米)放射狀網絡通道(形同硬質海棉塊)基質(甲基丙烯酸縮水甘油酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯)組成的園盤狀、園桶狀或管狀整體柱，通道壁骨架含有大量反應基團，可進行各種需要的化學修飾高密度地連接不同配基，通道孔高度互聯無盲端和死腔，流動相在其中可高速對流傳輸，分子動態結合能力(dynamicbindingcapacity,DBC)和分辨率受流速的影響很小，分離速度比多孔顆粒球形介質的經孔擴散滲透快10-20倍，其單一連續的整體結構導致穩定性極高和耐壓，可耐受2-10Mpa高壓，而顆粒介質低于0.5Mpa。從而，可實現生物大分子如核酸、蛋白質等的低壓和高通量高效分離純化。與顆粒介質柱相比，整體柱體積小，動態結合能力(載量)高，高流速高通量縮短了生產時間減少了超螺旋質粒的變構或降解，且攜帶使用方便，沒有顆粒介質柱的裝填柱、測柱效、預防和排氣泡、拆柱再裝填等煩惱，操作人員更樂于使用。顆粒液相層析分離系統有：凝膠過濾(又稱分子篩)層析，陰陽離子交換層析，疏水層析和親和層析四大類介質；Monoliths液相層析分離系統沒有凝膠過濾而有其他三類層析分離介質。此二系統均已成功地建立了自身體系的質粒純化方法，并且在繼續研發新的氨基酸-DNA親和介質改進提高開環與超螺旋質粒的分離效果。目前從培養的工程菌制備pDNA時，第一步普遍采用堿裂解法裂解含pDNA的大腸桿菌。此法可使大腸桿菌碎片、細菌的幾乎全部基因組gDNA和細胞壁、絕大部分細菌蛋白質、脂類、多糖等形成大塊凝聚物，通過離心或過濾而除去，遺留在裂解上清液中的主要成分為細菌自身的RNA，內毒素及少量細菌蛋白質和pDNA。其中與分子量較大的均一pDNA相比，細菌RNA是分子量較小而大小不均一的混合物，在凝膠電泳中呈現為位于pDNA單一致密條帶下方的云霧狀彌散帶，但其含量比pDNA高8-12倍，是純化pDNA時要去除的主要雜質。BIA公司當前推薦的正式pDNA純化方法包括以下基本步驟[2,3]：1)第一步：用堿裂解法裂解含質粒的大腸桿菌，在裂解上清液中加入終濃度0.5-1.0M的氯化鈣(CaCl2)，通過Ca++離子結合大部分RNA形成沉淀而離心去除，然后取上清液用德國產SartobrainP0.45/0.22μm囊式過濾器過濾又去除一部分Ca++離子結合的RNA，同時除去伴隨的內毒素；2)第二步：向澄清裂解液加入數倍TE(10-50mMTris-HCl+10mMEDTA,pH7.2)液或純凈水使其電導率降至35-40ms/cm，然后不濃縮直接加載(上樣)到CIMDEAE弱陰離子交換柱上，pDNA和剩余的RNA均結合于柱內孔道壁的配基，用0.6MNaCl-TE液洗滌除去結合不牢固的RNA，再用1.0MNaCl-TE液洗脫得到pDNA組分。此二步主要作用是去除RNA和收集pDNA組分；3)第三步：在收集的pDNA組分中加入終濃度3.0M的硫酸銨混合溶解均勻，加載(上樣)到CIMC4(丁基)疏水層析分離柱使質粒吸附，然后用1.7M硫酸銨-TE液洗滌除去開環(oc)質粒和殘留的內毒素等所有其他雜質，再用0.4M硫酸銨-TE液洗脫得到純化的超螺旋(sc)質粒組分，其純度的各項指標，包括細菌gDNA\RNA\內毒素等均可達到GMP(生產質量管理規范)的要求；將該純化組分用常規法脫鹽、濃縮、過濾除菌得到最終的藥物級質粒。本專利技術人在采用BIA推薦的正式方法純化質粒的數十次實驗中，對裂解液沉淀所用的氯化鈣濃度，兩個整體柱的洗滌、洗脫液濃度等對純化質粒的質和量的影響進行了仔細研究，發現：1)裂解液中加入CaCl2結合RNA形成的沉淀顆粒有大有小，大的可離心除去，小的需通過0.45/0.22μm囊式過濾器過濾才能除去，因此對所用過濾器的質量要求高，否則這些小顆?？赡芏氯w中的孔道減少其使用壽命。2)CaCl2沉淀去除RNA不完全，而且會同時去除相當部分的質粒，嚴重減少其回收。3)BIA方法依仗其整體柱的高通量高流速對裂解澄清液不濃縮，還因含0.5-1.0MCaCl2而需要加數倍體積的TE液稀釋降低電導率，從而使CIMDEAE柱的上樣體積大大增加而未能縮短加工時間；并且質粒依靠所帶電荷或疏水基團與介質配體的結合在高速水流(如8ml整體柱允許的最高流速為100ml/min)的沖擊下不夠牢固而可能部分丟失。4)CIMDEAE弱陰離子交換柱標示的核酸載量為6-8mg/ml(8ml柱48-64mg)，由于CaCl2處理過的裂解液仍含有不少RNA，它們競爭占據柱中的結合位點而減少了pDNA的結合和回收，即該柱不能滿載回收pDNA。本專利技術人用8mlCIMDEAE柱進行了多次實驗，其pDNA回收大都為16-18mg僅為其載量的1/3，未能充分發本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于藥物級核酸pDNA疫苗規?；苽涞馁|粒純化方法，其特征是聯合應用了顆粒介質液相分離系統與的整體柱液相層析分離系統，所述方法包括以下步驟：1)對宿主大腸桿菌的堿裂解液進行超濾濃縮；2)在中壓液相層析分離裝置中，將濃縮裂解液加載到顆粒介質凝膠過濾柱進行層析分離，收集第一峰質粒組分，去除后續的RNA大峰；3)將所得質粒組分加載到CIM?C4疏水整體柱或氨基酸?DNA親和整體柱進行層析分離，洗滌去除主要雜質，洗脫收集超螺旋質粒組分；4)將所得超螺旋質粒組分加載到CIM?DEAE離子交換整體柱進行層析分離，洗滌去除殘留雜質，洗脫收集得到純化的超螺旋質粒組分。

【技術特征摘要】
1.一種用于藥物級核酸pDNA疫苗規?；苽涞馁|粒純化方法，其特征是聯合應用了顆粒介質液相分離系統與的整體柱液相層析分離系統，所述方法包括以下步驟：1)對宿主大腸桿菌的堿裂解液進行超濾濃縮；2)在中壓液相層析分離裝置中，將濃縮裂解液加載到顆粒介質凝膠過濾柱進行層析分離，收集第一峰質粒組分，去除后續的RNA大峰；3)將所得質粒組分加載到CIMC4疏水整體柱或氨基酸-DNA親和整體柱進行層析分離，洗滌去除主要雜質，洗脫收集超螺旋質粒組分；4)將所得超螺旋質粒組分加載到CIMDEAE離子交換整體柱進行層析分離，洗滌去除殘留雜質，洗脫收集得到純化的超螺旋質粒組分。2.如權利要求1所述的聯合液相層析質粒純化方法，其中第1)步所述超濾濃縮采用截留分子量100kD-500kD的常規超濾裝置，將細菌堿裂解液濃縮5-10倍。3.如權利要求2所述的質粒純化方法，其中所述常規超濾裝置選自PES或改性PES材質制成的切向流中空纖維超濾裝置。4.如權利要求2所述的質粒純化方法，其中所述超濾濃縮過程中通過滲濾洗濾將細菌裂解液濃縮8-10倍。5.如權利要求1所述的質粒純化方法，其中第2)步采用的顆粒介質凝膠是高度交聯的瓊脂糖凝膠介質，凝膠過濾柱的平衡和洗滌液為TE液，加載的濃縮裂解液體積為柱體積的10-35...

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉慶良，李忠明，柯尊陽，
申請(專利權)人：固安鼎泰海規生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：河北,13