用于檢測6種呼吸道病毒的LAMP引物組合及其應用制造技術

本發明專利技術公開了用于檢測6種呼吸道病毒的LAMP引物組合及其應用。本發明專利技術提供的引物組合，由序列1至序列36所示的36種DNA分子組成。所述引物組合可應用于檢測待測病毒是否為甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、H5N1禽流感病毒、H7N9禽流感病毒、乙型流感病毒或人腺病毒，可應用于檢測待測樣本中是否含有甲型H1N1流感病毒和/或甲型H3N2流感病毒和/或H5N1禽流感病毒和/或H7N9禽流感病毒和/或乙型流感病毒和/或人腺病毒。本發明專利技術提供的引物組合用于檢測6種呼吸道病毒，具有高特異性和高靈敏度，可以實現簡便、快速、準確檢測。本發明專利技術具有重大的推廣價值。

LAMP primer combinations for detecting 6 respiratory viruses and their use

The present invention discloses LAMP primer combinations for detecting 6 respiratory viruses and their use. The primer assembly provided by the invention consists of 36 DNA molecules as shown in sequence 1 to sequence 36. The primer combinations can be used for detecting whether the virus for influenza a H1N1 influenza virus, influenza a H3N2 influenza virus, H5N1 avian influenza virus, H7N9 avian influenza virus, influenza B virus or human adenovirus, can be applied to detecting the sample is contained in the H1N1 influenza virus and influenza a H3N2 influenza virus and / or / or H5N1 avian influenza virus and / or H7N9 avian influenza virus and / or influenza B virus and / or human adenovirus. The primer combination provided by the invention is used for detecting 6 kinds of respiratory viruses, and has high specificity and high sensitivity, and can be conveniently, quickly and accurately detected. The invention has great popularization value.

【技術實現步驟摘要】
用于檢測6種呼吸道病毒的LAMP引物組合及其應用
本專利技術屬于生物
，具體涉及用于檢測6種呼吸道病毒的LAMP引物組合及其應用。
技術介紹
呼吸道感染分為上呼吸道感染與下呼吸道感染。上呼吸道感染90％左右由病毒引起，細菌感染常繼發于病毒感染之后。該病四季、任何年齡均可發病，通過含有病毒的飛沫、霧滴、或經污染的用具進行傳播。無論是下呼吸道感染還是上呼吸道感染，絕大部分是由病毒引起的，稱為病毒性呼吸道感染。流感病毒屬于正黏病毒科，分為甲型流感病毒(如甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、H5N1禽流感病毒、H7N9禽流感病毒等)、乙型流感病毒和丙型流感病毒三種。流感病毒是一種嚴重威脅人類健康的病原體，能感染廣泛宿主，每年季節性的流行造成全球約6億人感染，并導致25-50萬人死亡，其中造成感染和死亡的主要是甲型流感病毒。在過去的100多年里，流感病毒至少在全球范圍內引發過四次大流行，這幾次大流行都是因為動物源性的流感病毒跨越宿主屏障感染人所導致。近年在全球時見報道的主要是H5N1禽流感病毒和H7N9禽流感病毒，比如1997年在香港爆發的H5N1禽流感直接感染人并導致死亡；2013年在上海、安徽等地爆發的H7N9禽流感造成300多人感染，50多人死亡。這些事件證明流感病毒不但造成巨大經濟損失，同時還可能跨越宿主屏障直接感染人類，嚴重威脅人類公共衛生安全。腺病毒是一種沒有包膜的直徑為70～90nm的顆粒，由252個殼粒呈廿面體排列構成。衣殼里是線狀雙鏈DNA分子。人腺病毒(Humanadenovirus，HAdV)為腺病毒科的哺乳動物腺病毒屬成員之一，人腺病毒是引起嬰幼兒急性呼吸道感染等多種疾病的重要病原體之一。導致急性呼吸道感染的主要流行株為HAdV-3(人腺病毒3型)和HAdV-7(人腺病毒7型)，也可以引起其他系統的疾病，所致疾病的臨床表現與其它呼吸道病毒相關病毒相似，但多伴消化道癥狀。全球很多國家和地區曾發生腺病毒感染暴發，我國曾于上世紀發生嚴重的腺病毒感染暴發流行。呼吸道病毒的流行會給整個人類社會帶來重大安全問題。開展呼吸道病毒的快速檢測，對于重大傳染病疫情和生物恐怖的防控具有重要意義。發展針對呼吸道病毒多種病原體的快速檢測技術是及時發現傳染源，實施及時有效隔離和控制傳染源的關鍵。近年來，分子診斷方法(如聚合酶鏈式反應)被用于呼吸道病毒的檢測，它能夠準確地鑒定目標序列，但是它需要有熱循環系統的元件，這通常依賴于大型儀器且價格昂貴，不利于開展快速檢測。環介導等溫擴增法(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是利用一種具有鏈置換活性和瀑布式核酸擴增功能的BstDNA聚合酶，在等溫條件下進行核酸的變性和自動循環的鏈置換核酸擴增反應。LAMP針對靶序列的6個區域設計4條特異引物，利用具備鏈置換功能的DNA聚合酶在恒定溫度下不斷復制擴增DNA。為了提高反應效率，可在反應體系中添加兩條環引物，使之分別與莖環結構結合，啟動鏈置換合成，循環復制。LAMP具有簡便、快速、靈敏、特異的優勢，尤其適合在基層開展LAMP試劑盒的應用推廣。LAMP技術中，引物是決定檢測結果靈敏度和特異性的關鍵因素。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是如何檢測甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、H5N1禽流感病毒、H7N9禽流感病毒、乙型流感病毒和人腺病毒。為解決上述技術問題，本專利技術首先提供了一種引物組合，可為如下(a1)或(a2)或(a3)：(a1)由引物組Ⅰ、引物組Ⅱ、引物組Ⅲ、引物組Ⅳ、引物組Ⅴ和引物組Ⅵ組成；(a2)由所述引物組Ⅰ、所述引物組Ⅱ、所述引物組Ⅲ、所述引物組Ⅳ、所述引物組Ⅴ和所述引物組Ⅵ中的任意兩個、任意三個、任意四個或任意五個組成；(a3)所述引物組Ⅰ、所述引物組Ⅱ、所述引物組Ⅲ、所述引物組Ⅳ、所述引物組Ⅴ或所述引物組Ⅵ。所述引物組Ⅰ可由H1N1-F3、H1N1-B3、H1N1-FIP、H1N1-BIP、H1N1-LF和H1N1-LB組成；所述H1N1-F3可為如下(b1)或(b2)：(b1)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子；(b2)將序列1經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同功能的DNA分子；所述H1N1-B3可為如下(b3)或(b4)：(b3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子；(b4)將序列2經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功能的DNA分子；所述H1N1-FIP可為如下(b5)或(b6)：(b5)序列表的序列3所示的單鏈DNA分子；(b6)將序列3經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相同功能的DNA分子；所述H1N1-BIP可為如下(b7)或(b8)：(b7)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子；(b8)將序列4經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同功能的DNA分子；所述H1N1-LF可為如下(b9)或(b10)：(b9)序列表的序列5所示的單鏈DNA分子；(b10)將序列5經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列5具有相同功能的DNA分子；所述H1N1-LB可為如下(b11)或(b12)：(b11)序列表的序列6所示的單鏈DNA分子；(b12)將序列6經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列6具有相同功能的DNA分子。所述引物組Ⅱ可由H3N2-F3、H3N2-B3、H3N2-FIP、H3N2-BIP、H3N2-LF和H3N2-LB組成；所述H3N2-F3可為如下(c1)或(c2)：(c1)序列表的序列7所示的單鏈DNA分子；(c2)將序列7經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列7具有相同功能的DNA分子；所述H3N2-B3可為如下(c3)或(c4)：(c3)序列表的序列8所示的單鏈DNA分子；(c4)將序列8經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列8具有相同功能的DNA分子；所述H3N2-FIP可為如下(c5)或(c6)：(c5)序列表的序列9所示的單鏈DNA分子；(c6)將序列9經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列9具有相同功能的DNA分子；所述H3N2-BIP可為如下(c7)或(c8)：(c7)序列表的序列10所示的單鏈DNA分子；(c8)將序列10經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列10具有相同功能的DNA分子；所述H3N2-LF可為如下(c9)或(c10)：(c9)序列表的序列11所示的單鏈DNA分子；(c10)將序列11經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列11具有相同功能的DNA分子；所述H3N2-LB可為如下(c11)或(c12)：(c11)序列表的序列12所示的單鏈DNA分子；(c12)將序列12經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列12具有相同功能的DNA分子。所述引物組Ⅲ可由H5N1-F3、H5N1-B3、H5N1-FIP、H5N1-BIP、H5N1-LF和H5N1-LB組成；所述H5N1-F3可為如下(d1)或(d2)：(d1)序列表的序列13所示的單鏈DNA分子；(d2)將序列13本文檔來自技高網...

【技術保護點】
引物組合，為如下(a1)或(a2)或(a3)：(a1)由引物組Ⅰ、引物組Ⅱ、引物組Ⅲ、引物組Ⅳ、引物組Ⅴ和引物組Ⅵ組成；(a2)由所述引物組Ⅰ、所述引物組Ⅱ、所述引物組Ⅲ、所述引物組Ⅳ、所述引物組Ⅴ和所述引物組Ⅵ中的任意兩個、任意三個、任意四個或任意五個組成；(a3)所述引物組Ⅰ、所述引物組Ⅱ、所述引物組Ⅲ、所述引物組Ⅳ、所述引物組Ⅴ或所述引物組Ⅵ；所述引物組Ⅰ由H1N1?F3、H1N1?B3、H1N1?FIP、H1N1?BIP、H1N1?LF和H1N1?LB組成；所述H1N1?F3為如下(b1)或(b2)：(b1)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子；(b2)將序列1經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同功能的DNA分子；所述H1N1?B3為如下(b3)或(b4)：(b3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子；(b4)將序列2經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功能的DNA分子；所述H1N1?FIP為如下(b5)或(b6)：(b5)序列表的序列3所示的單鏈DNA分子；(b6)將序列3經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相同功能的DNA分子；所述H1N1?BIP為如下(b7)或(b8)：(b7)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子；(b8)將序列4經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同功能的DNA分子；所述H1N1?LF為如下(b9)或(b10)：(b9)序列表的序列5所示的單鏈DNA分子；(b10)將序列5經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列5具有相同功能的DNA分子；所述H1N1?LB為如下(b11)或(b12)：(b11)序列表的序列6所示的單鏈DNA分子；(b12)將序列6經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列6具有相同功能的DNA分子；所述引物組Ⅱ由H3N2?F3、H3N2?B3、H3N2?FIP、H3N2?BIP、H3N2?LF和H3N2?LB組成；所述H3N2?F3為如下(c1)或(c2)：(c1)序列表的序列7所示的單鏈DNA分子；(c2)將序列7經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列7具有相同功能的DNA分子；所述H3N2?B3為如下(c3)或(c4)：(c3)序列表的序列8所示的單鏈DNA分子；(c4)將序列8經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列8具有相同功能的DNA分子；所述H3N2?FIP為如下(c5)或(c6)：(c5)序列表的序列9所示的單鏈DNA分子；(c6)將序列9經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列9具有相同功能的DNA分子；所述H3N2?BIP為如下(c7)或(c8)：(c7)序列表的序列10所示的單鏈DNA分子；(c8)將序列10經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列10具有相同功能的DNA分子；所述H3N2?LF為如下(c9)或(c10)：(c9)序列表的序列11所示的單鏈DNA分子；(c10)將序列11經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列11具有相同功能的DNA分子；所述H3N2?LB為如下(c11)或(c12)：(c11)序列表的序列12所示的單鏈DNA分子；(c12)將序列12經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列12具有相同功能的DNA分子；所述引物組Ⅲ由H5N1?F3、H5N1?B3、H5N1?FIP、H5N1?BIP、H5N1?LF和H5N1?LB組成；所述H5N1?F3為如下(d1)或(d2)：(d1)序列表的序列13所示的單鏈DNA分子；(d2)將序列13經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列13具有相同功能的DNA分子；所述H5N1?B3為如下(d3)或(d4)：(d3)序列表的序列14所示的單鏈DNA分子；(d4)將序列14經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列14具有相同功能的DNA分子；所述H5N1?FIP為如下(d5)或(d6)：(d5)序列表的序列15所示的單鏈DNA分子；(d6)將序列15經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列15具有相同功能的DNA分子；所述H5N1?BIP為如下(d7)或(d8)：(d7)序列表的序列16所示的單鏈DNA分子；(d8)將序列16經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列16具有相同功能的DNA分子；所述H5N1?LF為如下(d9)或(d10)：(d9)序列表的序列17所示的單鏈DNA分子；(d10)將序列17經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列17具有相同功能的DNA分子；所述H5N1?LB為如下(d11)或(d12...

【技術特征摘要】
1.引物組合，為如下(a1)或(a2)或(a3)：(a1)由引物組Ⅰ、引物組Ⅱ、引物組Ⅲ、引物組Ⅳ、引物組Ⅴ和引物組Ⅵ組成；(a2)由所述引物組Ⅰ、所述引物組Ⅱ、所述引物組Ⅲ、所述引物組Ⅳ、所述引物組Ⅴ和所述引物組Ⅵ中的任意兩個、任意三個、任意四個或任意五個組成；(a3)所述引物組Ⅰ、所述引物組Ⅱ、所述引物組Ⅲ、所述引物組Ⅳ、所述引物組Ⅴ或所述引物組Ⅵ；所述引物組Ⅰ由H1N1-F3、H1N1-B3、H1N1-FIP、H1N1-BIP、H1N1-LF和H1N1-LB組成；所述H1N1-F3為如下(b1)或(b2)：(b1)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子；(b2)將序列1經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同功能的DNA分子；所述H1N1-B3為如下(b3)或(b4)：(b3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子；(b4)將序列2經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功能的DNA分子；所述H1N1-FIP為如下(b5)或(b6)：(b5)序列表的序列3所示的單鏈DNA分子；(b6)將序列3經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相同功能的DNA分子；所述H1N1-BIP為如下(b7)或(b8)：(b7)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子；(b8)將序列4經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同功能的DNA分子；所述H1N1-LF為如下(b9)或(b10)：(b9)序列表的序列5所示的單鏈DNA分子；(b10)將序列5經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列5具有相同功能的DNA分子；所述H1N1-LB為如下(b11)或(b12)：(b11)序列表的序列6所示的單鏈DNA分子；(b12)將序列6經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列6具有相同功能的DNA分子；所述引物組Ⅱ由H3N2-F3、H3N2-B3、H3N2-FIP、H3N2-BIP、H3N2-LF和H3N2-LB組成；所述H3N2-F3為如下(c1)或(c2)：(c1)序列表的序列7所示的單鏈DNA分子；(c2)將序列7經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列7具有相同功能的DNA分子；所述H3N2-B3為如下(c3)或(c4)：(c3)序列表的序列8所示的單鏈DNA分子；(c4)將序列8經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列8具有相同功能的DNA分子；所述H3N2-FIP為如下(c5)或(c6)：(c5)序列表的序列9所示的單鏈DNA分子；(c6)將序列9經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列9具有相同功能的DNA分子；所述H3N2-BIP為如下(c7)或(c8)：(c7)序列表的序列10所示的單鏈DNA分子；(c8)將序列10經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列10具有相同功能的DNA分子；所述H3N2-LF為如下(c9)或(c10)：(c9)序列表的序列11所示的單鏈DNA分子；(c10)將序列11經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列11具有相同功能的DNA分子；所述H3N2-LB為如下(c11)或(c12)：(c11)序列表的序列12所示的單鏈DNA分子；(c12)將序列12經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列12具有相同功能的DNA分子；所述引物組Ⅲ由H5N1-F3、H5N1-B3、H5N1-FIP、H5N1-BIP、H5N1-LF和H5N1-LB組成；所述H5N1-F3為如下(d1)或(d2)：(d1)序列表的序列13所示的單鏈DNA分子；(d2)將序列13經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列13具有相同功能的DNA分子；所述H5N1-B3為如下(d3)或(d4)：(d3)序列表的序列14所示的單鏈DNA分子；(d4)將序列14經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列14具有相同功能的DNA分子；所述H5N1-FIP為如下(d5)或(d6)：(d5)序列表的序列15所示的單鏈DNA分子；(d6)將序列15經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列15具有相同功能的DNA分子；所述H5N1-BIP為如下(d7)或(d8)：(d7)序列表的序列16所示的單鏈DNA分子；(d8)將序列16經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列16具有相同功能的DNA分子；所述H5N1-LF為如下(d9)或(d10)：(d9)序列表的序列17所示的單鏈DNA分子；(d10)將序列17經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列17具有相同功能的DNA分子；所述H5N1-LB為如下(d11)或(d12)：(d11)序列表的序列18所示的單鏈DNA分子；(d12)將序列18經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列18具有相同功能的DNA分子；所述引物組Ⅳ由H7N9-F3、H7N9-B3、H7N9-FIP、H7N9-BIP、H7N9-LF和H7N9-LB組成；所述H7N9-F3為如下(e1)或(e2)：(e1)序列表的序列19所示的單鏈DNA分子；(e2)將序列19經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列19具有相同功能的DNA分子；所述H7N9-B3為如下(e3)或(e4)：(e3)序列表的序列20所示的單鏈DNA分子；(e4)將序列20經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列20具有相同功能的DNA分子；所述H7N9-FIP為如下(e5)或(e6)：(e5)序列表的序列21所示的單鏈DNA分子；(e6)將序列21經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列21具有相同功能的DNA分子；所述H7N9-BIP為如下(e7)或(e8)：(e7)序列表的序列22所示的單鏈DNA分子；(e8)將序列22經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列22具有相同功能的DNA分子；所述H7N9-LF為如下(e9)或(e10)：(e9)序列表的序列23所示的單鏈DNA分子；(e10)將序列23經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列23具有相同功能的DNA分子；所述H7N9-LB為如下(e11)或(e12)：(e11)序列表的序列24所示的單鏈DNA分子；(e12)將序列24經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列24具有相同功能的DNA分子；所述引物組Ⅴ由B-F3、B-B3、B-FIP、B-BIP、B-LF和B-LB組成；所述B-F3為如下(f1)或(f2)：(f1)序列表的序列25所示的單鏈DNA分子；(f2)將序列25經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列25具有相同功能的DNA分子；所述B-B3為如下(f3)或(f4)：(f3)序列表的序列26所示的單鏈DNA分子；(f4)將序列26經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列26具有相同功能的DNA分子；所述B-FIP為如下(f5)或(f6)：(f5)序列表的序列27所示的單鏈DNA分子；(f6)將序列27經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列27具有相同功能的DNA分子；所述B-BIP為如下(f7)或(f8)：(f7)序列表的序列28所示的單鏈DNA分子；(f8)將序列28經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列28具有相同功能的DN...

【專利技術屬性】
技術研發人員：宋宏彬，王瑞麗，郝榮章，孔文，李楊，盧曉，孫明璇，趙榮濤，
申請(專利權)人：中國人民解放軍疾病預防控制所，
類型：發明
國別省市：北京,11