一種利用凝膠電泳鑒別綠潮滸苔屬藻類的方法技術

本發明專利技術屬于大型海藻生物檢測領域，特別涉及一種用凝膠電泳法鑒別4種主要的滸苔類綠藻(滸苔、扁滸苔、曲滸苔、緣管滸苔)的方法。本發明專利技術提供的方法，包括以下步驟：(1)藻體樣品總DNA提取；(2)5S?rDNA間隔區序列和ITS序列分別進行PCR擴增；(3)瓊脂糖凝膠電泳鑒別，電泳結束后，通過觀察電泳帶及其位置，通過條帶狀況分析判斷綠潮滸苔類藻種。本發明專利技術的有益效果是實驗操作簡單，無需送至測序公司進行測序，所以成本較低，耗時較短，數據準確。

A method of green tide Enteromorpha algae by gel electrophoresis identification

The invention belongs to the field of seaweed biological detection, and particularly relates to an identification of 4 main types of green algae Enteromorpha by electrophoresis (Enteromorpha, ulvacompessa, Enteromorpha, Ulva linza) method. The method of the invention comprises the following steps: (1) extraction of algae samples total DNA; (2) 5S rDNA intergenic sequences and ITS sequences were amplified by PCR; (3) agarose gel electrophoresis identification, after electrophoresis, with its position by observing the electrophoresis strip through case analysis to judge the green tide Enteromorpha algae type. The invention has the advantages of simple experimental operation and no need to be sent to the sequencing company for sequencing, so the cost is low, the time consuming is short, and the data is accurate.

【技術實現步驟摘要】
一種利用凝膠電泳鑒別綠潮滸苔屬藻類的方法
本專利技術屬于大型海藻生物檢測領域，特別涉及一種用凝膠電泳法鑒別4種主要的滸苔類綠藻(滸苔、扁滸苔、曲滸苔、緣管滸苔)的方法。
技術介紹
綠潮是在特定的環境條件下，海水中某些大型綠藻暴發性增殖、聚集而導致的一種有害生態現象。自20世紀70年代以來，綠潮在世界范圍內的發生頻率和影響規模呈現上升趨勢，美國、加拿大、丹麥、荷蘭、法國、意大利、日本、韓國和菲律賓等國家均有綠潮災害報道。我國自2007年開始連續十年在南黃海海域暴發大規模綠潮，初次之外，近幾年綠潮也陸續在我國沿海多地暴發，如廣西北海銀灘、廈門海滄湖、海南三亞大東海等，并呈現連續性和常態化的暴發趨勢。急劇增殖的綠潮藻給我國沿海城市的水產養殖業、旅游業、居民生活等帶來了諸多負面影響，造成了嚴重環境災害。對綠潮暴發主要藻種進行種類鑒別是綠潮研究中最重要的工作之一。我國黃海的綠潮藻主要有滸苔、緣管滸苔、曲滸苔和扁滸苔，其中滸苔為優勢種，具有生物量大、影響面積大、影響岸線長、遷移距離大等特點。常用的種類鑒別方法主要分為形態學鑒別法和分子生物學鑒別方法。形態學鑒別方法是一種傳統的分類鑒別方法，主要通過個體水平研究藻體的形態特征和生活史特點；細胞水平研究藻體細胞大小、細胞排列方式、細胞分裂特點和生殖發育方式等；亞細胞水平研究細胞器形態結構和定位特征等。技術方法主要涉及野外采集、純系培養、切片染色、光鏡電鏡技術等。依據研究結果，制訂相關分類標準作為水平鑒別依據。然而隨著研究發現，綠潮藻具有高度的形態可塑性，隨著環境變化，同一物種的形態特征具有很大差異，因此，單純依靠形態學鑒別方法對藻種進行鑒別具有一定難度。分子生物學方法的引入和使用，不僅補足了形態學鑒別方法的不足，同時也提供了更多藻種的進化和遺傳信息。常用的技術方法包括分子標記、環介導等溫擴增聯合橫向流動試紙條技術、滸苔的熒光原位雜交技術等。這些技術雖然都可以進行藻種鑒別，但是存在著耗時長或成本高等問題。
技術實現思路
本專利技術針對當前技術存在缺點和不足，專利技術了一種利用凝膠電泳鑒別綠潮滸苔屬藻類的方法，能快速有效的判斷綠潮藻種類，而且成本低，耗時短。本專利技術提供的利用凝膠電泳鑒別綠潮滸苔屬藻類的方法，包括以下步驟：(1)藻體樣品總DNA提取；(2)5SrDNA間隔區序列和ITS序列分別進行PCR擴增；其中，5SrDNA間隔區引物序列為：5S-F：5′-GGTTGGGCAGGATTAGTA-3′(18bp)，SEQIDNO.1；5S-R：5′-AGGCTTAAGTTGCGAGTT-3′(18bp),SEQIDNO.2；其中，ITS引物序列為：ITS-F：5′-TCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3′(21bp)，SEQIDNO.3；ITS-R：5′-TTCCTTCCGCTTATTGATATGC-3′(22bp)；SEQIDNO.4。(3)瓊脂糖凝膠電泳鑒別，電泳結束后，通過觀察電泳帶及其位置，通過條帶狀況分析判斷綠潮滸苔類藻種。具體為，配制濃度為1％的瓊脂糖凝膠，并加熱熔化至溶液清亮透明無顆粒，冷卻片刻，加入4SRedPlus核酸染料并混勻，倒入制膠平板中，插入梳子，待其凝固之后，小心拔出梳子，并把膠板放入電泳槽內，電泳槽內的電泳緩沖液量以沒過膠面1mm為宜，最后，取PCR擴增產物5ul加入被浸沒的凝膠加樣孔內，接通電源，一般150V電壓，電泳25min即可。電泳完畢，在凝膠成像儀上觀察電泳帶及其位置，通過條帶狀況分析判斷綠潮滸苔類藻種。其中，步驟(1)中所述藻體樣品總DNA提取的方法為采用植物基因組DNA提取試劑盒法對野外采集的樣品進行總DNA提取。其中，步驟(2)中的所述5SrDNA間隔區序列和ITS序列PCR擴增反應體系包括25ulPCRmix、10uM正反向引物各2ul、DNA模板2ul和雙重蒸餾水ddH2O19ul。其中，步驟(2)中的所述5SrDNA間隔區序列PCR擴增反應體系包括94℃預變性3min，94℃40s、52℃40s、72℃70s共30個循環，最后65℃延伸10min。其中，步驟(2)中的所述ITS序列PCR擴增反應體系包括94℃預變性5min，94℃40s、55℃40s、65℃70s共30個循環，最后65℃延伸10min。本專利技術的有益效果是實驗操作簡單，無需送至測序公司進行測序，所以成本較低，耗時較短，數據準確。附圖說明圖1是實施例1中5S序列擴增產物電泳膠圖圖2為實施例1中ITS序列擴增產物電泳膠圖。具體實施方式下面結合實施例，對本專利技術作進一步說明：實施例1自江蘇如東紫菜養殖笩架上采一定量的成體藻體樣品，并帶回實驗室。在實驗室中，用蒸餾水和毛刷對樣品進行刷洗，并挑選形態特征不同的藻體樣品，將藻體樣品用紙巾吸干，放入1.5ml的離心管中，之后進行如下步驟：(1)藻體樣品總DNA提取：按照天根植物基因組DNA提取試劑盒的步驟對江蘇如東紫菜養殖笩架采集的已預處理成體藻樣品進行總DNA提取。(2)5SrDNA間隔區序列及ITS序列PCR擴增：將步驟(1)中所提取的DNA進行ITS序列PCR擴增：在小離心管中按照50ul的PCR反應體系加入：25ulPCRmix、ITS正反向引物(10uM)各2ul、步驟(1)中所提取DNA2ul和雙重蒸餾水ddH2O19ul。放入PCR儀內。PCR反應程序為：94℃預變性5min，接著30個循環(94℃40s，55℃40s，65℃70s)，最后65℃延伸10min。之后，再次將步驟(1)中所提取的DNA進行5S序列PCR擴增：在小離心管中按照50ul的PCR反應體系加入：25ulPCRmix、5SrDNA間隔區序列正反向引物(10uM)各2ul、步驟(1)中所提取DNA2ul和雙重蒸餾水ddH2O19ul。放入另一臺PCR儀內。PCR反應程序為：94℃預變性3min，接著35個循環(94℃40s，52℃40s，72℃70s)，最后72℃延伸5min。其中，以上步驟所提到ITS引物序列為：ITS-F：5′-TCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3′(21bp)，ITS-R：5′-TTCCTTCCGCTTATTGATATGC-3′(22bp)，5SrDNA間隔區引物序列則為：5S-F：5′-GGTTGGGCAGGATTAGTA-3′(18bp)，5S-R：5′-AGGCTTAAGTTGCGAGTT-3′(18bp)。(3)瓊脂糖凝膠電泳鑒別：配制濃度為1％的瓊脂糖凝膠，并加熱熔化至溶液清亮透明無顆粒，冷卻片刻，加入4SRedPlus核酸染料并混勻，倒入制膠平板中，插入梳子，待其凝固之后，小心拔出梳子，并把膠板放入電泳槽內，電泳槽內的電泳緩沖液量以沒過膠面1mm為宜，最后，取步驟(2)中的所有PCR擴增產物各取5ul加入被浸沒的凝膠加樣孔內，接通電源，一般150V電壓，電泳25min即可。電泳完畢，在凝膠成像儀上觀察電泳帶及其位置，通過條帶狀況分析判斷綠潮藻種類。在凝膠成像儀上，首先觀察5S序列擴增產物電泳膠圖，如圖1，若電泳圖呈現雙條帶，則該檢測樣品為滸苔；若電泳圖呈現為單一條帶，則該檢測樣品為曲滸苔；若電泳圖呈現多條帶，則該檢測樣品為緣管滸苔；若電泳圖無條帶，觀察其ITS序列擴增產物電泳圖，如圖2，若有條本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種利用凝膠電泳鑒別綠潮滸苔屬藻類的方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)藻體樣品總DNA提取；(2)5S?rDNA間隔區序列和ITS序列分別進行PCR擴增；其中，5S?rDNA間隔區引物序列包括如SEQ?ID?NO.1所示的5S?F正向引物序列、如SEQ?ID?NO.2所示的5S?R反向引物序列；其中，ITS引物序列為包括如SEQ?ID?NO.2所示的ITS?F正向引物序列、如SEQ?ID?NO.3所示的ITS?R反向引物序列；(3)瓊脂糖凝膠電泳鑒別，電泳結束后，若電泳圖呈現雙條帶，則該檢測樣品為滸苔；若電泳圖呈現為單一條帶，則該檢測樣品為曲滸苔；若電泳圖呈現多條帶，則該檢測樣品為緣管滸苔；若電泳圖無條帶，觀察其ITS序列擴增產物電泳圖，有條帶，則該檢測樣品為扁滸苔。

【技術特征摘要】
1.一種利用凝膠電泳鑒別綠潮滸苔屬藻類的方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)藻體樣品總DNA提取；(2)5SrDNA間隔區序列和ITS序列分別進行PCR擴增；其中，5SrDNA間隔區引物序列包括如SEQIDNO.1所示的5S-F正向引物序列、如SEQIDNO.2所示的5S-R反向引物序列；其中，ITS引物序列為包括如SEQIDNO.2所示的ITS-F正向引物序列、如SEQIDNO.3所示的ITS-R反向引物序列；(3)瓊脂糖凝膠電泳鑒別，電泳結束后，若電泳圖呈現雙條帶，則該檢測樣品為滸苔；若電泳圖呈現為單一條帶，則該檢測樣品為曲滸苔；若電泳圖呈現多條帶，則該檢測樣品為緣管滸苔；若電泳圖無條帶，觀察其ITS序列擴增產物電泳圖，有條帶，則該檢測樣品為扁滸苔。2.根據權利要求1所述的利用凝膠電泳鑒別綠潮滸苔屬藻類的方法，其特征在于：步驟(1)中所述藻體樣品總DNA提取的方...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張建恒，王詩穎，何培民，王藝，霍元子，于克鋒，
申請(專利權)人：上海海洋大學，
類型：發明
國別省市：上海,31