一種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)副溶血弧菌的PCR檢測方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)副溶血弧菌的PCR檢測方法。提取水產(chǎn)養(yǎng)殖動物組織的總DNA；以所提取的DNA為模板，采用副溶血弧菌特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述的副溶血弧菌特異性引物是針對副溶血弧菌的recB基因的特異性引物P1或pyrH基因的特異性引物P2；根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠呈像結(jié)果判斷水產(chǎn)養(yǎng)殖動物是否被副溶血弧菌感染。本發(fā)明專利技術(shù)，使得水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)殘留副溶血弧菌的檢測更為簡便，為今后水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)殘留副溶血弧菌檢測和分析提供了必要的理論依據(jù)和完善的方法體系，同時為我國水產(chǎn)品病原菌檢測和我國食品進(jìn)出口安全奠定基礎(chǔ)。

PCR detection method for Vibrio parahaemolyticus in aquiculture animals

The invention relates to a PCR detecting method for Vibrio parahaemolyticus in aquiculture animals. Total DNA was extracted from the tissue of aquatic animal; with the extracted DNA as template, using Vibrio parahaemolyticus specific primers for PCR amplification primer specificity; Vibrio parahaemolyticus is the specific primers of P1 or pyrH gene targeting the recB gene of Vibrio parahaemolyticus by primer P2; according to the agarose gel PCR amplification was like the judgment of aquaculture animal is infected with Vibrio parahaemolyticus. The present invention, the detection of aquatic animal residues of Vibrio parahaemolyticus is more convenient, to provide the necessary theoretical basis and way to improve the system for future aquaculture residues in animal Vibrio parahaemolyticus detection and analysis, at the same time for the detection of pathogenic bacteria and aquatic products in China China's food import and export security foundation.

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
一種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)副溶血弧菌的PCR檢測方法
本專利技術(shù)屬于病原微生物檢測領(lǐng)域，具體的涉及一種養(yǎng)殖水產(chǎn)動物中常見的病原菌：副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)的PCR檢測方法。
技術(shù)介紹
副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)，是一種主要的食源性致病菌，嗜鹽的革蘭氏陰性細(xì)菌，屬弧菌科弧菌屬，廣泛分布于沿海、河口環(huán)境和魚、蝦、貝等海產(chǎn)品中。同時副溶血弧菌是一種引起食源性疾病的重要病原菌，可導(dǎo)致患者出現(xiàn)腹瀉、腸痙攣、惡心、嘔吐、發(fā)燒等典型胃腸炎反應(yīng)。研究數(shù)據(jù)表明，50％～70％因食用海產(chǎn)品引發(fā)的腹瀉病例是由副溶血弧菌引起的。目前國內(nèi)外對副溶血弧菌檢測方法主要有細(xì)菌生化方法、免疫學(xué)檢測方法、環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)、分析化學(xué)方法、分子生物檢測法。但存在著檢測方法復(fù)雜，靈敏性差等問題。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)殘留副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)的PCR檢測方法。本專利技術(shù)的方法可快速鑒定致病源，為我國水產(chǎn)品進(jìn)出口安全提供技術(shù)支持。本專利技術(shù)采用的技術(shù)方案是：一種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)副溶血弧菌的PCR檢測方法，方法如下：1)提取水產(chǎn)養(yǎng)殖動物組織的總DNA；2)以所提取的DNA為模板，采用副溶血弧菌特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述的副溶血弧菌特異性引物是針對副溶血弧菌的recB基因的特異性引物P1或pyrH基因的特異性引物P2；所述的特異性引物P1的上下游引物的序列是：P1-F:AGAAGAAGCGCCCGTTGAAG；P1-R:GCATGCAATCTGTGTGTCGG。所述的特異性引物P2的上下游引物的序列是：P1-F:AGTTATCGGTGGCGGTAACC；P1-R:GCCTGCTGAGAAGATTACAACG。PCR反應(yīng)條件：第一階段：94℃5min；第二階段：94℃30s，61℃或62℃30s，72℃30s；30循環(huán)；第三階段：72℃5min；第四階段：4℃保存。3)根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠呈像結(jié)果判斷水產(chǎn)養(yǎng)殖動物是否被副溶血弧菌感染。判斷標(biāo)準(zhǔn)為，針對特異性引物P1，如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠呈像結(jié)果有212bp條帶產(chǎn)生，則水產(chǎn)養(yǎng)殖動物被副溶血弧菌感染，否則沒有被感染；針對特異性引物P2，如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠呈像結(jié)果有253bp條帶產(chǎn)生，則大菱鲆被副溶血弧菌感染，否則沒有被感染。所述的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物為大菱鲆、海參、泥鰍魚、螃蟹、爬蝦、青蝦或三文魚。本專利技術(shù)的有益效果是：1.本專利技術(shù)，設(shè)計的副溶血弧菌特異性引物，能有效從各常見致病菌株中區(qū)分出副溶血弧菌，表現(xiàn)出很強(qiáng)的特異性。2.本專利技術(shù)，設(shè)計的副溶血弧菌特異性引物，靈敏性高，可有效檢出養(yǎng)殖水產(chǎn)品動物體內(nèi)殘留的副溶血弧菌，其最低檢測濃度可達(dá)到10-3ng/ul。3.本專利技術(shù)，所提供的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)殘留副溶血弧菌的PCR檢測方法，使得水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)殘留副溶血弧菌檢測更為簡便。在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物中，一旦存在病原菌副溶血弧菌，即能夠做到快速鑒定，為我國水產(chǎn)品進(jìn)出口提供有效的檢查方法。4.本專利技術(shù)的檢測方法可有效檢出水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)的高危致病菌副溶血弧菌，經(jīng)驗證此檢測方法特異性強(qiáng)，靈敏度高。該檢測方法的確立為今后水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)殘留病原菌副溶血弧菌的檢測和分析提供了必要的理論依據(jù)和完善的方法體系，不僅為我國水產(chǎn)品進(jìn)出口食品安全提供技術(shù)支持，同時為我國養(yǎng)殖水產(chǎn)品食品安全健康發(fā)展做出了貢獻(xiàn)。附圖說明圖1是實施例1副溶血弧菌特異性引物P1的PCR反應(yīng)條件優(yōu)化；其中，M:MarkerD，1-5:退火溫度分別為58℃，59℃，60℃，61℃，62℃。圖2是實施例1副溶血弧菌特異性引物P1的特異性驗證；其中，1.Vibriovulnificus；2.Vibriohollisae；3.Vibrioparahemolyticus；4.Vibrioharveyi；5.Vibriogigantis；6.Vibriocampbellii；7.Vibrioalginolyticus；8.Vibriometschnikovii；9.Vibriomimicus；10.Vibriocyclitrophicus；11..Aeromonashydrophila；12.Aeromonassalmonicida；13.Aeromonassobria14.Aeromonasveronii15.Pseudomonashelmanticensis；16.Pseudomonasaeruginosa；17.Pseudomonaskilonensis，18.Bordetellatrematum；M:MarkerD。圖3是實施例1副溶血弧菌特異性引物P1的PCR反應(yīng)靈敏性驗證。其中，M:MarkerD，1-7:模板濃度分別為101ng/ul，100ng/ul，10-1ng/ul，10-2ng/ul，10-3ng/ul，10-4ng/ul，10-5ng/ul。圖4是實施例1副溶血弧菌特異性引物P1對不同水產(chǎn)養(yǎng)殖動物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠成像結(jié)果；其中，M:MarkerD，1-7分別為注射0.1ml副溶血弧菌菌液的大菱鲆、海參、泥鰍魚、螃蟹、爬蝦、青蝦、三文魚組織；8-14分別為注射0.90％生理鹽水的大菱鲆、海參、泥鰍魚、螃蟹、爬蝦、青蝦、三文魚組織。圖5是實施例2副溶血弧菌特異性引物P2的PCR反應(yīng)條件優(yōu)化；其中，M:MarkerDL2000，1-5:退火溫度分別為57℃，58℃，59℃，60℃，61℃。圖6是實施例2副溶血弧菌特異性引物P2的特異性驗證；其中，1.Vibriovulnificus；2.Vibrioparahemolyticus；3.Vibrioharveyi；4.Vibriofluvialis；5.Vibriocampbellii；6.Vibrioalginolyticus；7.Vibriometschnikovii；8.Vibriomimicus；9.Vibriogigantis；10.Aeromonashydrophila；11.Aeromonassalmonicida；12.Aeromonasveronii；13.Pseudomonashelmanticensis；14.Pseudomonasaeruginosa；15.Pseudomonaskilonensis；16.BordetellatrematumM:MarkerDL2000。圖7是實施例2副溶血弧菌特異性引物P2的PCR反應(yīng)靈敏性驗證。其中，M:MarkerDL2000，1-7:模板濃度分別為101ng/ul，100ng/ul，10-1ng/ul，10-2ng/ul，10-3ng/ul，10-4ng/ul，10-5ng/ul。圖8是實施例2副溶血弧菌特異性引物P2對大菱鲆人工感染副溶血弧菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠成像結(jié)果；其中，M:MarkerDL2000，1-7分別為注射0.1ml副溶血弧菌菌液的大菱鲆肌肉組織，8-14分別為注射0.90％生理鹽水的大菱鲆肌肉組織。具體實施方式下面的實施例將對本專利技術(shù)予以進(jìn)一步的說明，但并不因此而限制本專利技術(shù)。實施例1(一)副溶血弧菌特異性引物的設(shè)計本實施例針對菌種副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】
一種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)副溶血弧菌的PCR檢測方法，其特征在于，方法如下：1)提取水產(chǎn)養(yǎng)殖動物組織的總DNA；2)以所提取的DNA為模板，采用副溶血弧菌特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述的副溶血弧菌特異性引物是針對副溶血弧菌的recB基因的特異性引物P1或pyrH基因的特異性引物P2；3)根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠呈像結(jié)果判斷水產(chǎn)養(yǎng)殖動物是否被副溶血弧菌感染。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)副溶血弧菌的PCR檢測方法，其特征在于，方法如下：1)提取水產(chǎn)養(yǎng)殖動物組織的總DNA；2)以所提取的DNA為模板，采用副溶血弧菌特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述的副溶血弧菌特異性引物是針對副溶血弧菌的recB基因的特異性引物P1或pyrH基因的特異性引物P2；3)根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠呈像結(jié)果判斷水產(chǎn)養(yǎng)殖動物是否被副溶血弧菌感染。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)副溶血弧菌的PCR檢測方法，其特征在于，所述的副溶血弧菌是Vibrioparahemolyticus。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)副溶血弧菌的PCR檢測方法，其特征在于，所述的特異性引物P1的上下游引物的序列是：P1-F:AGAAGAAGCGCCCGTTGAAGP1-R:GCATGCAATCTGTGTGTCGG所述的特異性引物P2的上下游引物的序列是：P1-F:AGTTATCGGTGGCGGTAACCP1-R...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉宏生，張新剛，鄒本堯，艾海新，
申請(專利權(quán))人：遼寧大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：遼寧,21