一種香菇申香18號菌種的SSR標記指紋圖譜及其構建方法與應用技術

本發明專利技術涉及一種香菇申香18號菌種的SSR標記指紋圖譜及其構建方法與應用，該指紋圖譜由8對SSR標記組成。構建方法包括：(1)菌絲培養；(2)基因組DNA的提取；(3)SSR分子標記的檢測；(4)電泳檢測。應用包括：對香菇菌種進行SSR標記擴增，將得到的帶型與指紋圖譜對照，與該指紋圖譜一致即為香菇申香18號菌種。本發明專利技術與常規形態學檢測、拮抗試驗、出菇試驗相比，具有檢測時間短、準確性高、可重復性好的優點，利用本發明專利技術構建的申香18號菌種SSR指紋圖譜，在收集的40個歷年來我國香菇主要栽培品種中具有專一性。

SSR labeled fingerprint of letinous edodes Shen Xiang 18 strain and construction method and application thereof

The invention relates to a SSR marking fingerprint of a letinous edodes flavor 18 bacterium and a construction method and an application thereof, wherein the fingerprint is composed of 8 pairs of SSR markers. The construction methods include: (1) Mycelium Culture; (2) extraction of genomic DNA; (3) detection of SSR molecular markers; (4) electrophoresis detection. The application includes: the strains are amplified by SSR markers, and the obtained bands are compared with the fingerprints, which is consistent with the fingerprints, that is, letinous edodes Shen Xiang No. 18 strain. The present invention and conventional morphological detection, antagonistic test and fruiting test compared with short detection time, high accuracy and repeatability, the invention constructs Shenxiang 18 strain SSR fingerprint in the collection of 40 main cultivars in China over the years, letinous edodes has specificity.

【技術實現步驟摘要】
一種香菇申香18號菌種的SSR標記指紋圖譜及其構建方法與應用
本專利技術屬于香菇菌種的檢測領域，特別涉及一種香菇申香18號菌種的SSR標記指紋圖譜及其構建方法與應用。
技術介紹
我國香菇產量已從1983年的1.95萬噸迅速發展到2015年的766萬噸，占全球香菇總產量的70％以上，改寫了世界食用菌產量的排行榜，并不斷縮小與排行第一的雙孢蘑菇產量差距，有專家預測，由于中國香菇產業的迅猛發展，在近10年內其將成為世界產量最高的食用菌。中國香菇以其驚人的發展速度，優質的品質及低廉的成本為世界菇業人士矚目，中國香菇已風靡世界。優質菌種在香菇單產和質量中的貢獻率舉足輕重，這決定了香菇菌種在香菇產業中的重要地位。1999年我國簽署了《國際植物新品種保護法》，這不僅要求我們尊重其它國家的品種知識產權，同時也要加強保護我們國家自己的品種知識產權，為了建立食用菌新品種登記制度來真正保護我國的品種產權，必須首先建立成熟的品種鑒定技術，為新品種登記奠定基礎。尤其日本2004年4月1日開始實行《種苗法修正案》，對我國食用菌尤其是香菇的出口構成了極大的威脅。就國內而言，香菇栽培菌種“同種異名，異種同名”的現象，不僅給菇農帶來了極大的損失，影響了他們的栽培積極性，也極大地影響了中國香菇的快速發展；而且，隨著大規模的工廠化栽培方式的出現，對香菇栽培菌株質量的要求越來越高，需要發展更為簡便、快速、準確的菌株鑒定技術，以保證每批次的用種都準確無誤。面對這種局勢，就需要進一步加快菌種鑒定技術的研究，在香菇的研究中引進更為有效的菌種鑒定體系。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是提供一種香菇申香18號菌種的SSR標記指紋圖譜及其構建方法與應用，該指紋圖譜與常規形態學檢測、拮抗試驗、出菇試驗相比，具有檢測時間短，準確性高，重復性好的優點。本專利技術的一種香菇申香18號菌種的SSR標記指紋圖譜，該指紋圖譜由8對SSR標記組成。SSR標記是基于香菇全基因組測序后開發的簡單重復序列片段(SSR)的擴增引物，經過對不同香菇品種進行PCR擴增后獲得的多態性標記。SSR標記具有擴增帶型好，重復性高的特點。本專利技術對大量的SSR引物進行了篩選，獲得了8對多態性高的引物，用這8對引物組合獲得的圖譜帶型，檢測目前我國主要栽培的40個香菇品種大多都具有專一性。這8對SSR標記的詳細信息如表1。表1SSR標記詳細信息列表本專利技術的一種香菇申香18號菌種的SSR標記指紋圖譜的構建方法，包括：(1)菌絲培養：將香菇菌種轉接到馬鈴薯葡萄糖培養基PDB中，23-25℃下避光搖瓶培養，3-4d后收集菌絲；(2)基因組DNA的提取：用CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)法提取上述菌絲的基因組DNA，紫外分光光度法檢測總基因組DNA濃度和純度，調整樣品DNA的濃度一致；(3)SSR分子標記的檢測：對上述提取的DNA進行8對SSR標記的PCR擴增；(4)電泳檢測：將上述PCR擴增得到的產物與加樣緩沖液混勻，變性，點樣于變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，銀染，顯色，拍照，分析結果。所述步驟(2)中的CTAB法提取菌絲的基因組DNA具體工藝包括：(1)將-20℃冷凍干燥的香菇菌絲研磨成粉末，加入65℃預熱的2×CTAB抽提液，于65℃保溫45-60min，輕搖混勻；(2)12000rpm、4℃離心20min，取上清液；(3)在上述上清液中加入體積比為25∶24∶1的酚、氯仿和異戊醇的混合液，混勻10min，12000rpm、4℃離心10min，取上清液移入離心管中；(4)在上述離心管中加入體積比為24∶1的氯仿和異戊醇混合液，混勻10min，12000rpm、4℃離心10min，取上清液移入另一離心管中；(5)在上述離心管中加入2/3體積(相對于步驟(4)中的上清液)的-20℃預冷的異丙醇，搖動5min，8000rpm、4℃離心10min，去上清；(6)將得到的沉淀用75vol％乙醇和10mmol/L醋酸鉀洗滌2-3次，每次8000rpm，室溫離心5min；(7)加入預冷的95vol％乙醇，上下顛倒，8000rpm室溫離心10min，棄乙醇，真空抽干或自然晾干；(8)加入100μL1×TE(Tris/EDTA)緩沖液，使沉淀溶解；(9)加入1μL10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；(10)將得到的DNA提取物于-20℃貯藏備用。所述步驟(3)中的PCR擴增體系為：總體積20μL，包括：10×PCRbuffer2μL，25mmol/LMgCl22μL，10mmol/LdNTP0.4μL，5U/μLTaqDNA酶0.2μL，10μmol/LSSR標記正向引物和反向引物總體積各1.5μL，濃度20-30ng/μL提取的模板DNA2μL，ddH2O10.4μL；PCR反應條件：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30個循環；72℃5min。所述步驟(4)中的加樣緩沖液用量為2μL；PCR擴增得到的產物點樣量為3μL。所述步驟(4)中的變性的具體工藝為：于95℃變性5min，結束后置于冰水混合物中冷卻3min。所述步驟(4)中的電泳的工藝參數為：變性聚丙烯酰胺凝膠的體積百分比濃度為6％，電泳緩沖液為1×TBE，電壓1000v，電流200mA，功率200W，電泳45min。所述步驟(4)中的銀染的具體工藝為：電泳完成后卸下并拆開玻璃板，膠板卸下后，用去離子水水洗5-8s，瀝干水分后，在銀染液中避光銀染8min，銀染后，用去離子水水洗5-8s，瀝干水分，放入顯影液中，至顯影后取出水洗后即可讀數。銀染液、顯影液均可用3-4次。該銀染顯影方法是常規方法的簡化，在高通量試驗中較為高效實用。所述銀染液的組成為1.5gAgNO3和1500mlH2O；顯影液的組成為16gNaOH、1000mlH2O和8ml甲醛。本專利技術的一種香菇申香18號菌種的SSR標記指紋圖譜的應用，是利用香菇基因組簡單重復序列片段開發的8對SSR引物，對擴增申香18號菌株的總DNA進行PCR擴增，申香18號菌種的擴增條帶在收集的40份我國香菇主要栽培品種中具有專一性。表2為本專利技術使用的8對SSR引物在40份香菇品種中擴增出的所有等位片段的數量及編號(按照擴增片段從大到小編號，通過對照50bpladderDNAmarker確定各SSR引物擴增的各等位片段的相對分子量)。菌種申香18號使用這8對SSR引物的擴增片段在總等位片段中的編號組合為：(0)(2+4)(3)(2+4)(3+4)(4)(1)(1)，表3為菌種申香18號擴增片段組合的位置與大小。符合上述等位片段組合的菌種，即是香菇申香18號菌種。表2SSR引物擴增的所有等位片段信息匯總表表3菌種申香18號擴增的等位片段編號表有益效果本專利技術與常規形態學檢測、拮抗試驗、出菇試驗相比，具有檢測時間短，準確性高，重復性好的優點。檢測所需時間只需要3-4d，而常規的拮抗試驗所需時間至少需要兩周時間，出菇試驗則需要至少3個月的時間；該方法在所收集的我國40個香菇主栽菌種中具有申香18號菌種的專一性，具有良好的應用前景。附圖說明圖1為香菇申香18號菌種的SSR標記指紋圖譜，其中M是50bpDNAladder，數字代表的是所用的8對SSR引物，箭頭所指的是香菇申香18號本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種香菇申香18號菌種的SSR標記指紋圖譜，其特征在于：該指紋圖譜由8對SSR標記組成，具體序列如下：1140正向引物：CCCAAAAAGGATTTCAGCAA；反向引物：AACCGGAGTGGTGTAAGTGC；76正向引物：AAGCAGGTCAGAGCAGGTTC；反向引物：ACCGAGAGCAGAGTCGAGAG；43正向引物：CTCTTTGCACCCTCAACCTC；反向引物：CAGCAGTCTCCTCTTGGCTC；16正向引物：ATAGGATGATTGAACGAGCAG；反向引物：ACCGTAAGGTGGGAAGAAA；19正向引物：ATGCCGTTCCAAAGATAC；反向引物：TCTGTAACGCTTGTGGACTA；148?1正向引物：CATTGCTCGGATCCTTCATT；反向引物：CATTGCTCGGATCCTTCATT；002正向引物：GGGCGAAACAATTTCAGGTA；反向引物：ATGCCATCGTAAGGAACTCG；192?1正向引物：ACGCGTATCCTCCCCTAAGT；反向引物：AAGCGATATGGATTTGACGC；所述菌種的帶型編號組合為：(0)(2+4)(3)(2+4)(3+4)(4)(1)(1)。...

【技術特征摘要】
1.一種香菇申香18號菌種的SSR標記指紋圖譜，其特征在于：該指紋圖譜由8對SSR標記組成，具體序列如下：1140正向引物：CCCAAAAAGGATTTCAGCAA；反向引物：AACCGGAGTGGTGTAAGTGC；76正向引物：AAGCAGGTCAGAGCAGGTTC；反向引物：ACCGAGAGCAGAGTCGAGAG；43正向引物：CTCTTTGCACCCTCAACCTC；反向引物：CAGCAGTCTCCTCTTGGCTC；16正向引物：ATAGGATGATTGAACGAGCAG；反向引物：ACCGTAAGGTGGGAAGAAA；19正向引物：ATGCCGTTCCAAAGATAC；反向引物：TCTGTAACGCTTGTGGACTA；148-1正向引物：CATTGCTCGGATCCTTCATT；反向引物：CATTGCTCGGATCCTTCATT；002正向引物：GGGCGAAACAATTTCAGGTA；反向引物：ATGCCATCGTAAGGAACTCG；192-1正向引物：ACGCGTATCCTCCCCTAAGT；反向引物：AAGCGATATGGATTTGACGC；所述菌種的帶型編號組合為：(0)(2+4)(3)(2+4)(3+4)(4)(1)(1)。2.一種如權利要求1所述的香菇申香18號菌種的SSR標記指紋圖譜的構建方法，包括：(1)將香菇菌種轉接到馬鈴薯葡萄糖液體培養基PDB中，23-25℃下避光搖瓶培養，3-4d后收集菌絲；(2)用CTAB法提取上述菌絲的基因組DNA，檢測總基因組DNA濃度和純度，調整樣品DNA的濃度一致；(3)對上述提取的DNA進行8對SSR標記的PCR擴增；(4)將上述PCR擴增得到的產物與加樣緩沖液混勻，變性，點樣于變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，銀染，顯色，拍照，分析結果。3.根據權利要求2所述的一種香菇申香18號菌種的SSR標記指紋圖譜的構建方法，其特征在于：所述步驟(2)中的CTAB法提取菌絲的基因組DNA具體工藝包括：(1)將-20℃冷凍干燥的香菇菌絲研磨成粉末，加入65℃預熱的2×CTAB抽提液，于65℃保溫45-60min，輕搖混勻；(2)12000rpm、4℃離心20min，取上清液；(3)在上述上清液中加入體積比為25∶24∶1的酚、氯仿和異戊醇的混合液，混勻10min，12000rpm、4℃離心10min，取上清液移入離心管中；(4)在上述離心管中加入體積比為24∶1的氯仿和異戊醇混合液，混勻10min，12000rpm、4℃離心10min，取上清液移入另一離心管中；(5)在上述離心管中加入2/3體積的-20℃預冷的異丙醇，搖動5min，8...

【專利技術屬性】
技術研發人員：董慧，尚曉冬，譚琦，章爐軍，宋春艷，張美彥，于海龍，姜寧，李玉，周峰，費如桂，
申請(專利權)人：上海市農業科學院，
類型：發明
國別省市：上海,31