與抗煙草赤星病基因緊密連鎖的分子標記引物及其應用制造技術

本發明專利技術公開了一種與抗煙草赤星病基因緊密連鎖的分子標記引物及其應用，所述與抗煙草赤星病基因緊密連鎖的分子標記引物J9擴增出的特異片段為230bp；J9的前引物TTCAGAACATAATTACCTTTAATTGG；后引物CGTGCTAAGGTCTTTGCTGTT；所述與抗煙草赤星病基因緊密連鎖的分子標記引物應用于以凈葉黃為抗源的組合進行后代分子標記輔助選擇。本發明專利技術篩選到與凈葉黃抗赤星病基因緊密連鎖的分子標記，方便快捷的對其雜交后代進行分子標記輔助選擇，加強對目標性狀的選擇和鑒定，提高育種效率，縮短育種年限，節省人力物力。

Molecular marker primer tightly linked with anti tobacco red spot disease gene and its application

The invention discloses an anti tobacco brownspot gene and molecular markers closely linked to primer and application specific fragment of the anti tobacco brownspot gene molecular markers closely linked primer J9 amplified primer TTCAGAACATAATTACCTTTAATTGG J9 230bp; before; after the primer CGTGCTAAGGTCTTTGCTGTT; the anti tobacco brownspot gene molecular markers closely linked with primer applied to jingyehuang for combination of anti sources are descendants of molecular marker assisted selection. The present invention screened with net leaf Huangkang brownspot gene closely linked molecular markers, convenient molecular marker assisted selection of hybrids, strengthen the selection and identification of target traits, improve the breeding efficiency and shorten the breeding period, save manpower and material resources.

【技術實現步驟摘要】
與抗煙草赤星病基因緊密連鎖的分子標記引物及其應用
本專利技術屬于生物工程
，尤其涉及一種與抗煙草赤星病基因緊密連鎖的分子標記引物及其應用。
技術介紹
煙草赤星病(TobaccoBrownSpot)是一種葉部病害，直接危害成熟期葉片，造成煙葉產量和質量的下降，若遇上適宜發病氣候極易造成大面積流行，使煙草生產遭受重大的經濟損失。研究煙草赤星病抗性遺傳規律，選育抗病品種，是防治此病害最經濟有效的手段之一。凈葉黃是我國最早育成的抗赤星病煙草品種，也是我國抗赤星病育種利用的主要抗源。利用凈葉黃的赤星病抗性，先后育成多個抗耐赤星病品種，包括許金4號、單育2號、中煙15、遼煙14、中煙86、中煙90等，對我國的煙草生產起到了很大的促進作用。赤星病接種鑒定工作，要在煙葉成熟期進行，而且需要保持較高的溫度和濕度，接種鑒定難度大，耗時耗力。因此，如果運用分子標記輔助選擇來進行抗赤星病育種，既可以免除接種鑒定等繁重工作，又能夠加快抗源篩選和抗性基因鑒定，促進抗性基因合理利用。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種與抗煙草赤星病基因緊密連鎖的分子標記引物，旨在免除接種鑒定等繁重工作，加快抗源篩選和抗性基因鑒定，促進抗性基因合理利用。本專利技術是這樣實現的，一種與抗煙草赤星病基因緊密連鎖的分子標記引物，所述與抗煙草赤星病基因緊密連鎖的分子標記引物J9擴增出的特異片段為230bp；J9前引物TTCAGAACATAATTACCTTTAATTGG；J9后引物CGTGCTAAGGTCTTTGCTGTT。本專利技術的主要目的在于提供一種與抗煙草赤星病基因緊密連鎖的分子標記引物用于以凈葉黃為抗源的組合進行后代分子標記輔助選擇。本專利技術的另一目的在于提供一種與抗煙草赤星病基因緊密連鎖的分子標記的獲取方法，所述獲取方法包括：提取抗赤星病材料凈葉黃和感赤星病材料NC82的DNA，以其為模板對2300對SSR引物進行多態性篩選，獲得多態性引物326對；用凈葉黃和NC82作為親本構建F2群體，將供試材料種植在溫室中。待其至成熟期時，利用劃傷懸滴法接種，每株接種兩片底部葉片，在用于接種葉片的主脈兩側用接種針做6個十字劃傷，在傷口處懸滴一滴接種菌液，保持高溫28℃、高濕相對濕度80％以上培養3周；按以下標準調查發病情況，0級：無癥狀；1級：有25％的劃傷略有浸染，但不擴展；2級：有50％的劃傷有浸染，且稍有擴展；3級：80％的劃傷有浸染，且形成病斑；4級：100％的劃傷有浸染，且形成很大病斑，被浸染處壞死。免疫：病級為0級；高抗：病級為1級；中抗：病級為2級；中感：病級為3級；高感：病級為4級。即0級、1級、2級劃為抗病群體，3級和4級劃為感病群體；在抗性鑒定的基礎上，將F2群體的110個單株分別提取DNA，隨機選10個抗病株的DNA等量混合建立抗病基因池；隨機選10個感病株的DNA等量混合建立感病基因池，以其為模板對篩選到的326對引物進行擴增檢測。篩選到在抗感池間有多態的引物76對，以F2群體的110個單株DNA為模板，對這76對引物進行擴增檢測，帶型統計方法如下：與凈葉黃帶型一致的記做0，與NC82帶型一致的記做1，與F1帶型一致的記做2，建立數據庫，用WindowsQTLCartographer軟件的CIM模塊進行數據整理分析，得到標記J9與來源于凈葉黃的赤星病抗性基因間的遺傳距離最近，為4cM。播種(凈葉黃×NC82)F2群體，隨機假植出400株，當煙苗生長到5葉期時，每株編號并取一片葉子提取DNA。以這些DNA為模板分別用J9進行擴增，其中得到有230bp特異片段的煙苗226株。將這226株煙苗移栽到赤星病鑒定棚中，按常規方式管理。當這些煙株長至成熟期時，利用劃傷懸滴法接種。每株接種兩片底部葉片，在用于接種葉片的主脈兩側用接種針做6個十字劃傷，保持高溫高濕培養3周后調查發病情況。其中抗病株數為205株，感病株數為11株，抗病株數占移栽總數的90.1％。這說明用J9對以凈葉黃為抗源的組合進行后代分子標記輔助選擇是有效可靠的。此外，本專利技術可以方便快捷的對其雜交后代進行分子標記輔助選擇，加強對目標性狀的選擇和鑒定，提高育種效率，縮短育種年限，節省人力物力。附圖說明圖1是本專利技術實施例提供的與抗煙草赤星病基因緊密連鎖的分子標記引物獲取流程圖。圖2是本專利技術實施例提供的引物J9對部分F2單株的擴增結果示意圖；圖中：M：DNAMarker；1：凈葉黃；2：NC82；3：F1代；4：F2代部分單株。圖3是本專利技術實例提供的部分F2單株的擴增檢測結果示意圖；圖中：1-19：F2代單株；M：DNAMarker。具體實施方式為了使本專利技術的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實例，對本專利技術進行進一步詳細說明。此處所描述的具體實例僅僅用以解釋本專利技術，并不用于限定本專利技術。下面結合附圖對本專利技術的應用原理作進一步描述。如圖1所示，本專利技術實例的與抗煙草赤星病基因緊密連鎖的分子標記引物獲取方法包括：S101：提取抗赤星病材料凈葉黃和感赤星病材料NC82的DNA，以其為模板對2300對SSR引物進行多態性篩選，獲得多態性引物326對；S102：用凈葉黃和NC82作為親本構建(凈葉黃×NC82)F2群體。將供試材料種植在溫室中。待其至成熟期時，利用劃傷懸滴法接種。每株接種兩片底部葉片，在用于接種葉片的主脈兩側用接種針做6個十字劃傷，在傷口處懸滴一滴接種菌液，保持高溫(28℃)、高濕(相對濕度80％以上)培養3周；S103：按以下標準調查發病情況。0級：無癥狀；1級：有25％的劃傷略有浸染，但不擴展；2級：有50％的劃傷有浸染，且稍有擴展；3級：80％的劃傷有浸染，且形成病斑；4級：100％的劃傷有浸染，且形成很大病斑，被浸染處壞死。免疫：病級為0級；高抗：病級為1級；中抗：病級為2級；中感：病級為3級；高感：病級為4級。即0級、1級、2級劃為抗病群體，3級和4級劃為感病群體；S104：在抗性鑒定的基礎上，將F2群體的110個單株分別提取DNA。隨機選10個抗病株的DNA等量混合建立抗病基因池；隨機選10個感病株的DNA等量混合建立感病基因池。以其為模板對篩選到的326對引物進行擴增檢測。篩選到在抗感池間有多態的引物76對。以F2群體的110個單株DNA為模板，對這76對引物進行擴增檢測，帶型統計方法如下：與凈葉黃帶型一致的記做0，與NC82帶型一致的記做1，與F1帶型一致的記做2，建立數據庫。用WindowsQTLCartographer軟件的CIM模塊進行數據整理分析，得到標記J9與來源于凈葉黃的赤星病抗性基因間的遺傳距離最近，為4cM；S105：J9擴增出的特異片段為230bp。J9的前引物序列如SEQIDNO：1和J9的后引物序列SEQIDNO：2和擴增圖片如下，引物J9對部分F2單株的擴增結果如圖2所示。J9的引物序列S106：分子標記與目標基因之間的遺傳距離決定了分子標記輔助選擇的準確率，遺傳距離越小準確率越高。本專利技術公開一個標記J9，它與抗性基因的遺傳距離僅為4cM，利用它進行輔助選擇，準確率會提高很多。下面結合具體實施例對本專利技術的應用原理作進一步的說明。播種(凈葉黃×NC82)F2群體，隨機假植出400株，當煙苗生長到5葉期時，每株編號并取一片葉子提取DNA。本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種與抗煙草赤星病基因緊密連鎖的分子標記引物，其特征在于，所述與抗煙草赤星病基因緊密連鎖的分子標記引物J9擴增出的特異片段為230bp；J9前引物??TTCAGAACATAATTACCTTTAATTGG；J9后引物??CGTGCTAAGGTCTTTGCTGTT。

【技術特征摘要】
1.一種與抗煙草赤星病基因緊密連鎖的分子標記引物，其特征在于，所述與抗煙草赤星病基因緊密連鎖的分子標記引物J9擴增出的特異片段為230bp；J9前引物TTCAGAACATAATTACCTTTAATTGG；J9后引物CGTGCTAAGGTCTTTGCTGTT。2.一種如權利要求1所述與抗煙草赤星病基因緊密連鎖的分子標記引物在于以凈葉黃為抗源的組合進行后代分子標記輔助選擇的應用。3.一種如權利要求1所述與抗煙草赤星病基因緊密連鎖的分子標記引物的獲取方法，其特征在于，所述獲取方法包括：提取抗赤星病材料凈葉黃和感赤星病材料NC82的DNA，以其為模板對2300對SSR引物進行多態性篩選，獲得多態性引物326對；用凈葉黃和NC82作為親本構建F2群體，將供試材料種植在溫室中，待其至成熟期時，利用劃傷懸滴法接種，每株接種兩片底部葉片，在用于接種葉片的主脈兩側用接種針做6個十字劃傷，在傷口處懸滴一滴接種菌液，保持高溫28℃、高濕相對濕度80％以上培養3周；按以下標準調查發病情況，0級：無癥狀；1...

【專利技術屬性】
技術研發人員：蔣彩虹，王元英，楊愛國，羅成剛，任民，程立銳，馮全福，耿銳梅，張玉，
申請(專利權)人：中國農業科學院煙草研究所，
類型：發明
國別省市：山東,37