一種用于肝癌易感基因早篩的核酸質譜的檢測方法技術

本發明專利技術涉及基因檢測領域，具體涉及一種用于肝癌易感基因早篩的核酸質譜的檢測方法。本發明專利技術考慮了中國人群與歐美人群肝癌基因譜的差異性，篩選出與中國人肝癌易感相關基因的SNPs以及與肝癌相關的基因突變位點的組合，利用核酸質譜儀對肝癌相關的遺傳學標識進行廣泛(高通量檢測位點、高通量檢測樣本)篩查和檢驗。通過本發明專利技術的方法檢出成功率高、技術重現性好、性價比高，可實現單個小樣本多基因的檢測，滿足小樣本最大化使用；本發明專利技術的方法是基于MassARRAY核酸質譜技術，較Sanger測序具有高準確性、高靈敏性的技術優勢，檢測結果穩定，提高了檢測陽性率。

A detection method of nucleic acid mass spectrometry for early screening of the susceptibility genes of liver cancer

The present invention relates to the field of gene detection, in particular to a method for detecting nucleic acid mass spectrometry for early screening of the susceptibility genes of liver cancer. The invention considers the difference spectrum of liver cancer gene Chinese population in Europe and the United States population, screening and Chinese liver cancer susceptible genes related to SNPs and in combination with the liver cancer related gene mutations, using nucleic acid mass spectrometry identification of hepatocellular carcinoma associated genetics are widely (high flux detection sites, high-throughput screening and testing samples) test. Through the method of the invention of the detection technology of high success rate, good reproducibility and high performance price ratio, we can detect the single small sample and multi gene, meet the small sample maximum use; the method of the invention is MassARRAY nucleic acid mass spectrometry based on technical advantages compared with Sanger sequencing with high accuracy, high sensitivity, stable test results, improve the positive rate of detection.

【技術實現步驟摘要】
一種用于肝癌易感基因早篩的核酸質譜的檢測方法
本專利技術屬于基因檢測領域，具體涉及一種用于肝癌易感基因早篩的核酸質譜的檢測方法。
技術介紹
原發性肝癌(HepatocellularCarcinoma,HCC)是我國乃至全世界上常見，且具有危害性的惡性腫瘤之一，我國每年新發病例約占全球45％，是全世界致死率高居第三的惡性腫瘤，盡管隨著各種新技術、新療法的出現和診療水平的提高，肝癌的療效有了很大的改善，但是我國肝癌年死亡率仍高達20.40/10萬，約占全世界肝癌死亡率的1/2。肝癌的發生是多基因多因素參與的復雜過程，是環境與遺傳因素共同作用的結果。研究學者發現：肝癌發生發展是一個受遺傳學調控的過程。近年來遺傳學機制在肝癌發生發展中的作用已成為研究的重點內容。單核苷酸多態性(singlenucleotidepolymorphism，SNPs)是一種遺傳標記，是指基因組水平上由于單核苷酸的變異，而引起的DNA序列的多態性。在人群中的發生頻率大于1％，包括單堿基的轉換、顛倒以及單堿基的插入或缺失等形式表現，是一種新的遺傳標志，可以為疾病的預測、診斷、治療以及新型藥物的研制提供可靠的有效的科學根據。SNP在疾病基因定位中所發揮的作用主要包括：1.在疾病定位區域中尋找致病SNP，這種SNP的出現可能直接導致了基因轉錄水平上和翻譯水平上的變化，即改變了基因表達量或者基因產物蛋白質的組成結構，從而導致某種疾病發生或使得個體對某種特殊的環境易感；2.SNP作為一個遺傳標記，與疾病或表型緊密連鎖。近年來利用SNP預測疾病的發生發展已經成為臨床和科研工作者的熱點，且在腫瘤和心腦血管等重大疾病預測上的應用價值已初見端倪。目前，關于肝癌早期對小肝癌行肝葉切除，還有治愈的希望。臨床研究表明，肝癌發現得越早，治療效果越好，還能提高病人的預后及存活率，但是肝癌起病比較隱匿，約80％的患者確診時多為中晚期。這在很大程度上增加了肝癌患者的死亡率。而目前臨床上早期篩查HCC的主要指標是血清甲胎蛋白(AFP)水平和影像學B超檢測。但是一部分HCC患者血清AFP長期保持低水平(<20ng/ml)，而B超在檢測和進一步判斷結節的特征時有一定的局限性，從而影響到肝癌早期診斷的靈敏性。目前臨床尚未有十分有效的早期檢查方法，因此建立高靈敏，經濟，簡單的分子技術篩查方法尤為重要。
技術實現思路
本專利技術為了克服現有技術的上述不足，提供了一種肝癌易感基因的核酸質譜早篩的方法，此方法篩選出與肝癌易感相關基因的SNPs以及與肝癌相關的基因突變位點，利用核酸質譜儀對肝癌相關的遺傳學標識進行廣泛篩查和檢驗，為肝癌發病風險的預測、預防和診斷提供依據。本專利技術的目的是通過以下技術方案實現的：一種用于肝癌易感相關基因的核酸質譜早篩的方法，該方法包括如下步驟：(1)篩選出可用來評估個體罹患肝癌風險的特異性和敏感性的基因SNPs和基因突變位點；(2)設計步驟(1)的肝癌易感SNPs位點和基因突變位點的擴增引物和單堿基延伸引物；(3)將步驟(2)中的擴增引物分組，各組中所含的各SNP位點和基因突變位點的上下游引物等摩爾混合，得到對應的擴增引物混合液，每管擴增引物混合液的最終工作濃度為0.5μM；(4)依照步驟(3)中擴增引物分組的方式，將步驟(2)中的單堿基延伸引物分組，每一組根據其所含的每一條延伸引物的分子量，按相應體積進行混合，分別得到單堿基延伸引物混合液；(5)以待測樣品外周血基因組DNA為模板，對步驟(3)中的每組擴增引物混合液分別進行PCR擴增，所得擴增產物最終在4℃保存；(6)應用核酸外切酶和蝦堿式磷酸酶消化步驟(5)的擴增產物；(7)將步驟(6)純化后的產物進行單堿基延伸反應：分別將步驟(6)中純化后的每組擴增產物加入步驟(4)中對應的延伸引物混合液，即第一組擴增產物加入第一組延伸引物混合液，第二組擴增產物加入第二組延伸引物混合液，第三組擴增產物加入第三組延伸引物混合液；(8)脫鹽樹脂純化延伸產物；(9)MassARRAY平臺檢測分析進行芯片點樣、掃描，檢測結果使用TYPER4.0軟件(sequenom)分型并輸出結果，通過觀察質譜峰變異堿基處是否出峰來判斷是否存在基因變異。進一步地，所述可用來評估個體罹患肝癌風險的特異性和敏感性的基因SNPs位點在NCBI中的SNP數據庫的rs號分別為rs4730775、rs2233682、rs17006625、rs1800630、rs7574865、rs4678680、rs12979860、rs1056836、rs34237608、rs230496、rs1800566、rs28362491、rs17401966、rs4444903、rs2596542、rs648202、rs455804、rs9267673、rs2280883、rs3761549、rs9275319、rs9272105和rs8013403。進一步地，所述可用來評估個體罹患肝癌風險的特異性和敏感性的基因突變位點分別為c.121A>G、c.110C>G、c.133T>C和c.747G>T。進一步地，所述肝癌易感SNPs基因位點和肝癌易感基因突變位點的PCR引物、延伸引物的序列為：rs4730775PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTGAAGGGTGATGGGCAGTTAG-3'下游5'-ACGTTGGATGGTTTCCAGAGCTAACTCGTG-3'延伸引物：5'-TTAGCAGACGGCGGA-3'rs2233682PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCCGAGTGTACTACTTCAACC-3'下游5'-ACGTTGGATGTGCCCGTTTTTGCCACCACT-3'延伸引物：5'-gCACTAACGCCAGCCA-3'rs17006625PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGACCTTCTTCTCCTTTTGCCG-3'下游5'-ACGTTGGATGGGGAAGATGAGGTTGAATTG-3'延伸引物：5'-GCCGGGGCAGTTATCA-3'rs1800630PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGCTATGGAAGTCGAGTATGG-3'下游5'-ACGTTGGATGTTCCATACCTGGAGGTCCTG-3'延伸引物：5'-GCCCTGTCTTCGTTAAG-3'rs7574865PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGAGTGTGTATGCAGTAAAAG-3'下游5'-ACGTTGGATGAATCCCCTGAAATTCCACTG-3'延伸引物：5'-GTTGGTGACCAAAATGT-3'rs4678680PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCATGGGACTCTGATACAATA-3'下游5'-ACGTTGGATGTTCTGCCTTGGGTTTGTTC-3'延伸引物：5'-TGCTTTCTTCCCTTTTCT-3'rs12979860PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTCGTGCCTGTCGTGTACTGA-3'下游5'-ACGTTGGATGAGCGCGGAGTGCAATTCAAC-3'延伸引物：5'-caCAATTCAAC本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于肝癌易感相關基因的核酸質譜早篩的方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)篩選出可用來評估個體罹患肝癌風險的特異性和敏感性的基因SNPs和基因突變位點；(2)設計步驟(1)的肝癌易感SNPs位點和基因突變位點的擴增引物和單堿基延伸引物；(3)將步驟(2)中的擴增引物分組，各組中所含的各SNP位點和基因突變位點的上下游引物等摩爾混合，得到對應的擴增引物混合液，每管擴增引物混合液的最終工作濃度為0.5μM；(4)依照步驟(3)中擴增引物分組的方式，將步驟(2)中的單堿基延伸引物分組，每一組根據其所含的每一條延伸引物的分子量，按相應體積進行混合，分別得到單堿基延伸引物混合液；(5)以待測樣品外周血基因組DNA為模板，對步驟(3)中的每組擴增引物混合液分別進行PCR擴增，所得擴增產物最終在4℃保存；(6)應用核酸外切酶和蝦堿式磷酸酶消化步驟(5)的擴增產物；(7)將步驟(6)純化后的產物進行單堿基延伸反應：分別將步驟(6)中純化后的每組擴增產物加入步驟(4)中對應的延伸引物混合液，即第一組擴增產物加入第一組延伸引物混合液，第二組擴增產物加入第二組延伸引物混合液，第三組擴增產物加入第三組延伸引物混合液；(8)脫鹽樹脂純化延伸產物；(9)MassARRAY平臺檢測分析進行芯片點樣、掃描，檢測結果使用TYPER4.0軟件(sequenom)分型并輸出結果，通過觀察質譜峰變異堿基處是否出峰來判斷是否存在基因變異。...

【技術特征摘要】
1.一種用于肝癌易感相關基因的核酸質譜早篩的方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)篩選出可用來評估個體罹患肝癌風險的特異性和敏感性的基因SNPs和基因突變位點；(2)設計步驟(1)的肝癌易感SNPs位點和基因突變位點的擴增引物和單堿基延伸引物；(3)將步驟(2)中的擴增引物分組，各組中所含的各SNP位點和基因突變位點的上下游引物等摩爾混合，得到對應的擴增引物混合液，每管擴增引物混合液的最終工作濃度為0.5μM；(4)依照步驟(3)中擴增引物分組的方式，將步驟(2)中的單堿基延伸引物分組，每一組根據其所含的每一條延伸引物的分子量，按相應體積進行混合，分別得到單堿基延伸引物混合液；(5)以待測樣品外周血基因組DNA為模板，對步驟(3)中的每組擴增引物混合液分別進行PCR擴增，所得擴增產物最終在4℃保存；(6)應用核酸外切酶和蝦堿式磷酸酶消化步驟(5)的擴增產物；(7)將步驟(6)純化后的產物進行單堿基延伸反應：分別將步驟(6)中純化后的每組擴增產物加入步驟(4)中對應的延伸引物混合液，即第一組擴增產物加入第一組延伸引物混合液，第二組擴增產物加入第二組延伸引物混合液，第三組擴增產物加入第三組延伸引物混合液；(8)脫鹽樹脂純化延伸產物；(9)MassARRAY平臺檢測分析進行芯片點樣、掃描，檢測結果使用TYPER4.0軟件(sequenom)分型并輸出結果，通過觀察質譜峰變異堿基處是否出峰來判斷是否存在基因變異。2.根據權利要求1所述的一種用于肝癌易感相關基因的核酸質譜早篩的方法，其特征在于：所述可用來評估個體罹患肝癌風險的特異性和敏感性的基因SNPs位點在NCBI中的SNP數據庫的rs號分別為rs4730775、rs2233682、rs17006625、rs1800630、rs7574865、rs4678680、rs12979860、rs1056836、rs34237608、rs230496、rs1800566、rs28362491、rs17401966、rs4444903、rs2596542、rs648202、rs455804、rs9267673、rs2280883、rs3761549、rs9275319、rs9272105和rs8013403。3.根據權利要求1所述的一種用于肝癌易感相關基因的核酸質譜早篩的方法，其特征在于：所述可用來評估個體罹患肝癌風險的特異性和敏感性的基因突變位點分別為c.121A>G、c.110C>G、c.133T>C和c.747G>T。4.根據權利要求1所述的一種用于肝癌易感相關基因的核酸質譜早篩的方法，其特征在于：所述肝癌易感SNPs基因位點和肝癌易感基因突變位點的PCR引物、延伸引物的序列為：rs4730775PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTGAAGGGTGATGGGCAGTTAG-3'下游5'-ACGTTGGATGGTTTCCAGAGCTAACTCGTG-3'延伸引物：5'-TTAGCAGACGGCGGA-3'rs2233682PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCCGAGTGTACTACTTCAACC-3'下游5'-ACGTTGGATGTGCCCGTTTTTGCCACCACT-3'延伸引物：5'-gCACTAACGCCAGCCA-3'rs17006625PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGACCTTCTTCTCCTTTTGCCG-3'下游5'-ACGTTGGATGGGGAAGATGAGGTTGAATTG-3'延伸引物：5'-GCCGGGGCAGTTATCA-3'rs1800630PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGCTATGGAAGTCGAGTATGG-3'下游5'-ACGTTGGATGTTCCATACCTGGAGGTCCTG-3'延伸引物：5'-GCCCTGTCTTCGTTAAG-3'rs7574865PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGAGTGTGTATGCAGTAAAAG-3'下游5'-ACGTTGGATGAATCCCCTGAAATTCCACTG-3'延伸引物：5'-GTTGGTGACCAAAATGT-3'rs4678680PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCATGGGACTCTGATACAATA-3'下游5'-ACGTTGGATGTTCTGCCTTGGGTTTGTTC-3'延伸引物：5'-TGCTTTCTTCCCTTTTCT-3'rs12979860PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTCGTGCCTGTCGTGTACTGA-3'下游5'-ACGTTGGATGAGCGCGGAGTGCAATTCAAC-3'延伸引物：5'-caCAATTCAACCCTGGTTC-3'rs1056836PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTCCTTGTCCAAGAATCGAGC-3'下游5'-ACGTTGGATGCAACCAGTGGTCTGTGAATC-3'延伸引物：5'-TCCGGGTTAGGCCACTTCA-3'rs34237608PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGTGGAGTCAGACAGATATGG-3'下游5'-ACGTTGGATGCAGGCACCTGGGAAGACTA-3'延伸引物：5'-CCTGGGAAGACTAGATGAG-3'rs230496PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGACCACATGTCTGGATTTGC-3'下游5'-ACGTTGGATGTGGGCCACCTTTAAGAGTAG-3'延伸引物：5'-ggtgAGGTCAGGGGCAAAC-3'rs28362491PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTCTATCAGCGGCACTGCCAC-3'下游5'-ACGTTGGATGTAGGGAAGCCCCCAGGAAG-3'延伸引物：5'-tCCTGCGTTCCCCGACCATTG-3'rs1800566PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTGTGCCCAATGCTATATGTC-3'下游5'-ACGTTGGATGTTCTGTATCCTCAGAGTGGC-3'延伸引物：5'-acGGCTTCCAAGTCTTAGAA-3'rs17401966PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCCAGCACTTAATGAAAACAC-3'下游5'-ACGTTGGATGAACCTCTAAGAACACTTGAC-3'延伸引物：5'-CTAAGAACACTTGACTCAATA-3'rs4444903PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTCTTTCAGCCCCAATCCAAG-3'下游5'-ACGTTGGATGAGAGCAAGGCAAAGGCTTAG-3'延伸引物：5'-gaaaTGATG...

【專利技術屬性】
技術研發人員：尚小云，劉夢梅，刁波，
申請(專利權)人：武漢賽云博生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：湖北,42