融合微脂粒及供微脂粒融合所用之酸誘導性法制造技術

當介質的ｐＨ值降至７以下時，含有磷脂酰乙醇胺，棕櫚酰高半胱胺酸或油酸或棕櫚酸的微脂粒快速地發生融合．微脂粒的融合作用系借（ａ）如同共振能之轉移所示，將諸微脂粒脂質混合，（ｂ）膠過濾法及（ｃ）電子顯微術測知．含有磷脂酰乙醇胺和棕櫚酰高半胱胺酸（８：２）的微脂粒在融合期間，幾乎所有包含的鈣黃綠素都會釋出．微脂粒中包含有膽脂醇（４０％）時，則可真正地減少漏失而不損及融合作用．使那些對ｐＨ靈敏的微脂粒融合，可以將生物活性分子，諸如ＤＮＡ等遞送至活細胞中．（*該技術在2005年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】
本專利技術系指融合微脂粒，被PH控制之微脂粒融合作用，及這些微脂粒作為制藥或類似制劑之載體時的用途。當微脂粒介質之PH被制成酸性時，含有(例如)磷脂酰乙醇胺及棕櫚酰高半胱胺酸之微脂粒快速地發生融合。 微脂粒系為含有一個或多個微脂粒雙層之囊胞，此微脂粒雙層是完全圍繞內部的水性空間。它們通常系由磷脂或其他脂族分子以單純形式或以與其他分子諸如脂醇，長鏈酸或堿，或膜蛋白質等結合之形式制成。微脂粒之結構可為多層大囊胞(0.5至5微米)至單層小囊胞(250-750埃)形式。習慣上是根據大小來分類微脂粒，并使用三個字的字頭語來命名所論及的微脂粒型。多層囊胞一般命名為(MLV)。單層小囊胞一般命名為(SUV)。而單層大囊胞則命名為(LUV)。下列之每一事例中的化學組合物一般是以字頭語稱之。參見D·Papahadjopoulos，Ann，N·Y·Acad，Sci308 1(1978)and Ann·Rpts·Med·Chem，14 250(1979)，其說明已入本文中以供參考。 微脂粒制劑可由多種技術制得，其中包括乙醇注射法，(Batzri et al，Biochim，Biophys，Acta，298 1015(1973));醚浸漬法，(Deamer et al，Biochim，Biophys，Acta，443 629(1976))及Schiern et al，Biochim，Biophys·ACta，542 137(1978))，去垢劑移去法，(Razin，Biochim，Biophys·Acta，265 241(1972))，溶劑蒸發法，(Matsumato et al，J·Colloid Interface Sci，62 149(1977))，油(REV)乳濁液中之水之蒸發法(SZoka Jr·et al.，Proc·Natl·Acad·Sci·USA，75 4194(1978))，及MLV及LUV經由核孔聚碳酸鹽膜之擠壓法(Olson et al.，Biochim，Biophys，Acta，557 9(1979)。 微脂粒可用于影響試管試驗及活體試驗中的細胞活動。Wagee及Miller(Nature，235 399(1972)的報告中首先指出，帶有抗病毒抗體之微脂粒可保護細胞避免受到病毒感染。Greoriadis及Buckland(Nature，244 170(1973))同樣地觀察到微脂粒對細胞之保護作用，其觀點認為含有蔗糖酶之微脂粒可導致小鼠之腹膜巨噬細胞中之貯藏蔗糖空泡消失。Papa hadjopoulos及Coworkers(Biochim·Biophys·Acta，323 23(1973)中指出，微脂粒可誘導細胞融合而不發生細胞毒性反應。 微脂粒已用以影響細胞對暫時性分子(即尋常不能吸收的分子)之吸收能力。此效用致使微脂粒可作為外來物質(諸如藥等)的載體。例如，在試管試驗中，環狀AMP對STS細胞生長之抑制作用可借助使用微脂粒作為載體而增強1000倍(Papahadjopoulos et al.，Nature，252 163(1974)及Papahadjopoulos et al.，Biochim Biophys·Acta，363 404(1974))。類似之增強效應也在Papahadjopoulos et al.，Cancer Res.，36 4406(1976)中述及，指出微脂粒中之放射菌D對抗抗藥之田鼠細胞系的效力。 在適度酸性情況下之膜融合作用是感染多數封皮病毒，包括圣利基森林(Semliki Forest)病毒(Marsh，et al.，Cold Spring Harbor Symp·Ouant·Biol 46 835(1982)及White et al.，J·Cell Biol·89 674(1981)，水泡性口炎病毒及流行性感昌病毒(White et al.，如上)等的原因。酸誘導性膜粘合作用之正確機理尚未得知。有關微脂粒之研究的顯示為，由azolectin所制得之微脂粒可在PH6.5下與粒線體之內膜融合(Schneider et al.，Natl Acad.Sci.USA，77 442-446(1980))，血清白蛋白(Schenkman et al.，Chem.Phys，Lipids，649 633(1981)及Schenkman et al.，Chem.Phys.Lipids，28 165(1981)及其蛋白分解片段(Chaimovich et al.，Biophys.J.，41 28a(1983))可在低于PH4以下的情況下誘導微脂粒發生融合。Blumenthal et al.，指出，Clathrin于PH6.5以下可誘導中性微脂粒發生融合(Blumenthal et al.，Biol.Chem.，258 3409(1983)。所有事例中，微脂粒之融合均需要某種蛋白質或其它大分子的存在。 Allens等人(J.Cell Biol.97 10)(a)，Abstr，No.419(1983))在報告中指出，含有磷脂酰乙醇胺及膽脂醇半琥珀酸酯之微脂粒，于漿質體之PH范圍內對PH是靈敏的。這些微脂粒在漿質體進行酸化作用時，與漿質體之膜融合，因而將其內容物傳遞到細胞質。 Straubinger及Coworkers(J.Cell.Biol.97 109(a)，Abstr No.420(1983))的報告中指出在微酸性PH下會成為不穩定的微脂粒之制法。這些含有油酸，磷脂酰乙醇胺及膽脂醇(3∶7∶3的摩爾比率)之微脂粒在PH7.0以下，對陰離子螢光染料(Cacein)具有滲透性。這些微脂粒促使內藏之Calcein傳遞到CV-1細胞之細胞質中。 本專利技術系指(1)融合微脂粒，(2)使微脂粒融合之方法(3)這些微脂粒供細胞之顯微鏡下注射法(即傳遞制藥或其他制劑)使用時之用途。當微脂粒之介質被處理成PH酸性時，則微脂粒(制成對PH靈敏)發生融合。當這些微脂粒大于含有一個或更多個弱酸官能基團(如羧基團)的兩性分子，其摩爾百分比約為20時，微脂粒變得對PH靈敏。此種之化合物包括棕櫚酰高半胱胺酸之長鏈，(即C12至C30，最好為C16至C24)脂肪酸諸如棕櫚酸及油酸等。存在具有形成六方相或轉化性微胞趨勢之兩性分子諸如磷脂酰乙醇胺等，可大大地增強融合的過程。以下的一個示范實例中，磷脂酰乙醇胺對棕櫚酰高半胱胺酸之理想比率為8∶2。 附圖的簡單說明 圖1描述微脂粒，在酸處理前(a)及酸處理后(b)以Biogel A 50M膠過濾法測得的圖形。設標示及未標示的微脂粒在脂質濃度為200×10-6M及n＝3的情況下混合。測量各部分在缺乏(1)及存在本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種融合微脂粒之方法，其中包括：（１）制造含有至少２０摩爾百分比兩性分子（含一個或多個弱酸官能基團）之微脂粒；（２）將這些來自步驟（ａ）之微脂粒的ＰＨ降至低于ＰＨ７。

【技術特征摘要】
1、一種融合微脂粒之方法，其中包括(1)制造含有至少20摩爾百分比兩性分子(含一個或多個弱酸官能基團)之微脂粒；(2)將這些來自步驟(a)之微脂粒的PH降至低于PH7。2、根據權利要求1的方法其中上述兩性分子的弱酸官能基團系為一個或多個羧基團。3、根據權利要求2的方法，其中上述之兩性分子系為長鏈(C12至C30)脂肪酸。4、根據權利要求3的方法，其中上述長鏈脂肪酸系由棕櫚酸及油酸所擇定。5、根據權利要求2的方法，其中上述兩性分子系為棕櫚酰高半胱酸。6、根據權利要求1的方法，其中在步驟(b)內，PH值被降至6.0以下。7、根據權利要求1的方法，其中在步驟(b)內，PH值被降低至5.0以下。8、根據權利要求1的方法，其中，步驟(b)系使用水性無機酸進行。9、根據權利要求8的方法，其中，水性無機酸為鹽酸。10、根據權利要求1的方法，其中此方法又包括形成步驟(a)內之微脂粒而該微脂粒含有可形成六方相趨勢之兩性分子。11、根據權利要求10的方法，其中上述六方相兩性分子系為磷脂酰乙醇胺或其酸加成性長鏈(C16-C24)酯。12、根據權利要求11的方法，其中上述長鏈酯系為二油酰磷脂酰乙醇胺。13、根據權利要求12的方法，其中二油酰磷脂酰乙醇胺對上述含一個或多個弱酸官能基團之兩性分子之摩爾比約為8∶2。14、根據權利要求13的方法，其中上述含一個或多個弱酸官能基團之兩性分子系由棕櫚酰高半胱胺酸，棕櫚酸及油酸所擇定。15、將外來的物質插至活細胞中之方法，其中此方法包括(a)將外來物料裝至由兩性分子(含一個多或多個弱酸官能基團)所制成之PH靈敏性微脂粒中;且(b)令上述活細胞與上述已內封之PH靈敏性微脂粒接觸，因而發生插入作用。16、根據權利要求15的方法，其中...

【專利技術屬性】
技術研發人員：利夫黃，康納，
申請(專利權)人：田納西大學研究公司，
類型：發明
國別省市：US[美國]