由培養(yǎng)液分離動(dòng)物細(xì)胞的方法技術(shù)

由動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)，分離出動(dòng)物細(xì)胞和／或動(dòng)物細(xì)胞碎片的過程，包括用多聚半乳糖醛酸來絮凝細(xì)胞，及把這些絮凝了的動(dòng)物細(xì)胞和／或動(dòng)物細(xì)胞碎片，從培養(yǎng)液分離出來．（*該技術(shù)在2005年保護(hù)過期，可自由使用*）

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)是關(guān)于由動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液中分離出動(dòng)物細(xì)胞和/或動(dòng)物細(xì)胞碎片的過程，這過程最適合用于由培養(yǎng)液分離出雜種瘤。 分子生物學(xué)近年來的發(fā)展，導(dǎo)致了精細(xì)發(fā)酵方法和儀器的需求的增加，特別是人們對應(yīng)用多種技術(shù)處理的動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行大量培養(yǎng)以便由這些細(xì)胞生產(chǎn)出多肽提取物和蛋白質(zhì)，這過程的一個(gè)步驟，是要把動(dòng)物細(xì)胞和/或動(dòng)物細(xì)胞碎片，從培養(yǎng)液分離出來，這是從培養(yǎng)液分離出細(xì)胞產(chǎn)物的首要步驟。 傳統(tǒng)的分離方法，是把動(dòng)物細(xì)胞用離心分離方法，從培養(yǎng)液分離出來。這方法通常效率低，因?yàn)橐ＷC完全分離的話，就需要相對長的時(shí)間來獲得相當(dāng)大加速度。另外一個(gè)辦法，就是過濾出培養(yǎng)液，但是這個(gè)做法，很容易使過濾器被動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)胞的殘片堵塞。所有兩種辦法，都可能丟除及帶走動(dòng)物細(xì)胞及有用的細(xì)胞產(chǎn)物，并且沒法把細(xì)胞碎片和培養(yǎng)液上清液完全分離。 本專利技術(shù)的目的，提高由培養(yǎng)基分離動(dòng)物細(xì)胞能力。 已經(jīng)知道的，絮凝微生物培養(yǎng)液，有助于由培養(yǎng)液分離微生物細(xì)胞;這種方法例子是把澄清劑加進(jìn)不透明的愛爾啤酒內(nèi)，澄清劑會(huì)使酵母菌和酵母菌碎片絮凝，最后沉淀在釀酒器的底部。 在一般情況下，動(dòng)物細(xì)胞物質(zhì)的表面，都帶有凈負(fù)電荷。由于靜電引力，不同極性的顆粒串接形成絮凝。我們可以相信，帶有正電荷的物質(zhì)，會(huì)絮凝動(dòng)物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞碎片。很奇怪，我們發(fā)覺帶負(fù)電的溶化了的聚合物，對絮凝動(dòng)物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞碎片，竟然很有功效。此外，我們試驗(yàn)了多種帶負(fù)電溶解的聚合物，只有一種顯示出有絮凝的極滿意效果，我們假定，這是由于聚合物表面上的電荷分布和細(xì)胞上的帶正電荷區(qū)域相互匹配所造成的。 按照本專利技術(shù)，我們提出一種把動(dòng)物細(xì)胞和/或動(dòng)物細(xì)胞碎片，從動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液分離出來的方法必包括在培養(yǎng)液內(nèi)混入多聚半乳糖醛酸，使動(dòng)物細(xì)胞和/或動(dòng)物細(xì)胞碎片絮凝，再從培養(yǎng)液分離出絮凝了的動(dòng)物細(xì)胞和/或動(dòng)物細(xì)胞碎片。 使用多聚半乳糖醛酸作絮凝劑，有多種好處。這些在物理分離前的動(dòng)物細(xì)胞和/或動(dòng)物細(xì)胞碎片的絮凝，可以顯著地增加產(chǎn)品產(chǎn)量，培養(yǎng)基的純度，及加快整體分離過程的速度。動(dòng)物細(xì)胞碎片，由于它們的體積細(xì)小，很多時(shí)候都很難除去，但是使用本專利技術(shù)的話，就不但能夠絮凝動(dòng)物細(xì)胞，還能夠絮凝動(dòng)物細(xì)胞碎片。此外，使用本專利技術(shù)的工藝，只有少量的動(dòng)物細(xì)胞由培養(yǎng)液的上清液中帶走。多聚半乳糖醛酸本身不含毒素，供應(yīng)方便，價(jià)錢也便宜，它是由果膠脫酰得到的。 這多聚半乳糖醛酸可以是多聚半乳糖醛酸本身，或是任何能夠使動(dòng)物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞碎片絮凝的多聚半乳糖醛酸衍生物。如果多聚半乳糖醛酸是基本上溶于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液，它的分子量可以在一寬的范圍內(nèi)變化。同樣地，多聚半乳糖醛酸的濃度通常也可以大范圍變化，而事實(shí)上因?yàn)檫@有效濃度是受到細(xì)胞密度的影響，所以多聚半乳糖醛酸的濃度是沒法準(zhǔn)確劃定范圍。不過，可行的濃度上限由使細(xì)胞培養(yǎng)液變?yōu)槟z的多聚半乳糖醛酸濃度決定。這一點(diǎn)顯然是不理想。濃度的下限是由動(dòng)物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞碎片基本上開始絮凝的濃度來確定的。在一般的培養(yǎng)液內(nèi)，多聚半乳糖醛酸濃度至少可以是0.004%(重量/體積)，最好是大約0.03%。 動(dòng)物細(xì)胞和/或動(dòng)物細(xì)胞碎片隨重力沉淀后，可以使用過濾法或離心分離法，從液體分離絮凝了的動(dòng)物細(xì)胞和/或動(dòng)物細(xì)胞碎片。所獲得清澈上清液，再可進(jìn)行純化，得到由動(dòng)物細(xì)胞所產(chǎn)生的多肽或蛋質(zhì)。上述的過程，當(dāng)然可以用于那些例如聲波振動(dòng)破壞了的細(xì)胞(在細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi))。 動(dòng)物細(xì)胞，也許是在活體外生長的天然存在的動(dòng)物細(xì)胞，不過，最好是一些遺傳變異了的動(dòng)物細(xì)胞，理想的動(dòng)物細(xì)胞，有雜種瘤細(xì)胞，例如是從家鼠或田鼠衍生的雜化種細(xì)胞，此外，這些動(dòng)物細(xì)胞也可以是人的成淋巴瘤細(xì)胞，動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生抗體(IgM或IgG)的情況，在動(dòng)物細(xì)胞和/或動(dòng)物細(xì)胞碎片絮凝的過程中，只有少量抗體由培養(yǎng)基液中排出，因此大量抗體得保留下來。 絮凝時(shí)，理想培養(yǎng)液至少調(diào)整至酸性的PH值，因?yàn)樗嵝缘腜H值可確保細(xì)胞表面的氨基團(tuán)和組氨酸殘馀物的質(zhì)子化作用，由此增加了細(xì)胞上正電荷區(qū)域。低于PH3時(shí)，聚合物被電離;較好的PH值是PH4和PH7之間，PH值最好是在PH5和PH6之間。 培養(yǎng)液可以是任何合適培養(yǎng)基，例如是Dulbecco Modified Eagle Medium(DMEM)或L-Broth。 用舉例方法來說明本專利技術(shù)。 例一 實(shí)驗(yàn)實(shí)施將用來證明，是在培養(yǎng)液中產(chǎn)生抗體IgM的雜種瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基上，大量帶負(fù)電可溶性聚合物的絮凝能力。這實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，著重說明多聚半乳糖醛酸在這方面的非凡特性。 含有5%少牛胎血清和Dulbecco Modifhed EagleMedium培養(yǎng)基內(nèi)，使用一般滾筒培養(yǎng)技術(shù)，培養(yǎng)出產(chǎn)生IgM的雜種瘤細(xì)胞(NBI-一種家鼠雜種瘤)。細(xì)胞繁殖通常在對數(shù)生長的階段的末期，這時(shí)候細(xì)胞的密度和細(xì)胞殘馀物的數(shù)量是最大。制備下列的帶負(fù)電聚合物水溶液多聚半乳糖醛酸(4%重量/體積)、分子量8000的葡聚糖硫酸酯(10%重量/體積)、分子量500，000的葡聚糖硫酸酯(8%重量/體積)、藻酸、Carageenan(一種海藻糖)、DEAE-葡聚糖、聚谷氨酸、聚硫酸乙烯酯。 使用IMHU或固態(tài)三HU堿，把培養(yǎng)基(50ml)的PH，分別拉到在5.0、7.0及9.0。在15ml刻度試管內(nèi)，加入10ml每種PH值樣品，再加進(jìn)要試驗(yàn)的絮凝劑，重覆倒轉(zhuǎn)試管來混合液體。把全部試管直立放置，及分別在2小時(shí)后18小時(shí)后來觀察。用離心法澄清一組PH值為5.0含多聚半乳糖醛酸試管。澄清的上清液抽樣，然后使用ELISA驗(yàn)定法測量IgM的濃度。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表一。 藻酸、Carageenan(一種海藻糖)、葡聚糖凝酯(D·E·A·E·)-葡聚糖、聚谷氨酸、與及聚硫酸乙烯酯等，都是無法在1%(重量/體積)濃度產(chǎn)生絮凝。一在0.04%(重量/體積)和0.0004%(重量/體積)之間濃度的多聚半乳糖醛酸絮凝的培養(yǎng)基產(chǎn)生上清液中沒檢測出IgM。 例二 例一描述的實(shí)驗(yàn)，展示了多聚半乳糖醛酸，在培養(yǎng)液內(nèi)絮凝雜種瘤細(xì)胞的能力。這部分試驗(yàn)已擴(kuò)大到實(shí)驗(yàn)工廠的水平。 用下列的方法，繁殖及得到30升的培養(yǎng)基。把CO2吹入培養(yǎng)發(fā)酵器內(nèi)，使培養(yǎng)液的PH下降到5.0至6.0之間。視雜種瘤細(xì)胞和細(xì)胞碎片的密度，多聚半乳糖醛酸加進(jìn)0.04%至0.1%間濃度培養(yǎng)液中，再加入大約50毫升體積的絮凝劑。把它們在發(fā)酵器內(nèi)混合，之后，停止CO2氣體的供應(yīng)，讓絮凝過程進(jìn)行。需1個(gè)小時(shí)讓絮凝了的細(xì)胞和細(xì)胞碎片沉淀。跟著，把絮凝了的細(xì)胞和細(xì)胞碎片，用卷曲的聚丙烯深過濾片(標(biāo)稱0.1微米小孔直徑)來過濾，或使用Westfalia SA-I分離器進(jìn)的連續(xù)地離心分離。使用這兩種方法獲得的上清液，比使用傳統(tǒng)分離技術(shù)獲得的上清液更清。這種更大范圍試驗(yàn)用100升及1000升的培養(yǎng)基反覆進(jìn)行成功。另外，已表明用5M H2SO4也可降低PH值，并且在加入前多聚半乳糖醛酸溶解水中形成的濃度(重量/體積)為20%以利進(jìn)行試驗(yàn)。 例三 用100升培養(yǎng)基量的家鼠雜種瘤細(xì)胞系和人的淋巴瘤細(xì)胞系(EB變異的淋巴細(xì)胞)，重覆例二所描述的實(shí)驗(yàn)。在這兩種情況中都能夠成功成功地絮凝和分離動(dòng)物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞碎片。 當(dāng)然，大家應(yīng)該知道，這里所描述的內(nèi)容及例子，純本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
由動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)，分離出動(dòng)物細(xì)胞和／或動(dòng)物細(xì)胞碎片的過程，特征是其包括用多聚半乳糖醛酸來絮凝細(xì)胞，及把這些絮凝了的動(dòng)物細(xì)胞和／或動(dòng)物細(xì)胞碎片，從培養(yǎng)液分離出來。

【技術(shù)特征摘要】
1、由動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)，分離出動(dòng)物細(xì)胞和/或動(dòng)物細(xì)胞碎片的過程，特征是其包括用多聚半乳糖醛酸來絮凝細(xì)胞，及把這些絮凝了的動(dòng)物細(xì)胞和/或動(dòng)物細(xì)胞碎片，從培養(yǎng)液分離出來。2、根據(jù)權(quán)利要求1的過程，特征是那些絮凝了的動(dòng)物細(xì)胞和/動(dòng)物細(xì)胞碎片，是用過濾法或離心法從培養(yǎng)液分離出來。3...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：肯尼，
申請(專利權(quán))人：細(xì)胞技術(shù)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：GB[英國]