介導除蟲菌素B2:B1比例的除蟲鏈霉菌基因制造技術

本發明專利技術涉及包含有編碼ａｖｅＣ基因產物的核苷酸序列的多核苷酸分子，該多核苷酸分子可被用于改變除蟲鏈霉菌發酵培養物中所產生的除蟲菌素２類∶１類的比例或量。本發明專利技術進一步涉及載體、宿主細胞和除蟲鏈霉菌的突變菌株，其中ａｖｅＣ基因已經被失活或突變以改變所產生的除蟲菌素２類∶１類的比例或量。（*該技術在2019年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】
1．專利
本專利技術涉及除蟲菌素的組合物及除蟲菌素的生產方法，主要應用于動物健康領域。更具體地，本專利技術涉及包含有編碼aveC基因產物的核苷酸序列的多核苷酸分子，該多核苷酸分子可被用于調整除蟲鏈霉菌培養物發酵所產生的除蟲菌素2類∶1類的比例，本專利技術還涉及篩選該多核苷酸分子的組合物及方法。本專利技術進一步涉及到載體，轉化的宿主細胞，除蟲鏈霉菌的新型突變株(其中aveC基因已經被突變以調整所產生的除蟲菌素2類∶1類的比例)。2．專利技術背景2．1．除蟲菌素鏈霉菌可產生各種各樣的次級代謝產物，其中包括除蟲菌素，其含有一系列八種相關的能產生有效的抗蠕蟲和殺昆蟲活性的十六員的大環內脂類化合物，這八種截然不同但又密切相關的化合物主要指A1a,A1b,A2a,A2b,B1a,B1b,B2a及B2b。“a”系列化合物指的是天然除蟲菌素，其在C25位的取代基為(S)-仲丁基，“b”系列化合物指的是C25位的取代基為異丙基的那些化合物。代號“A”及“B”指的是C5位取代基分別為甲氧基和羥基的除蟲菌素；數字“1”指的是在C22位及C23位為雙鍵的除蟲菌素。而數字“2”為C22位有一個氫原子及在C23位有一個羥基的除蟲菌素；在這些相關的除蟲菌素中，B1型的除蟲菌素被公認為具有最強的抗寄生蟲和殺害蟲活性，因而也是最具商業前景的除蟲菌素。除蟲菌素及其通過除蟲鏈霉菌菌株需氧發酵的生產方法在美國專利4,310,519及4,429,042中都已有描述。天然除蟲菌素的生物合成被認為可以通過異丁酸及S-(+)-2-甲基丁酸的輔酶A硫代脂類似物內源性起始。經過隨機誘變進行菌株改進并聯合使用外源提供的脂肪酸可以有效生產除蟲菌素類似物。支鏈二氧酸脫氫酶缺陷的除蟲鏈霉菌的突變體(bkd缺陷突變體)只有在補充有脂肪酸發酵時才能產生除蟲菌素。篩選和分離支鏈脫氫酶活性缺陷的突變體(如除蟲鏈霉菌，ATCC 53567)在歐洲專利(EP)276103中已有描述。在有外源提供的脂肪酸存在下發酵這些突變體的結果為對應于所使用的脂肪酸僅產生四種除蟲菌素。因此，用S-(+)-2-甲基丁酸補充除蟲鏈霉菌(ATCC 53567)發酵，結果產生天然除蟲菌素A1a,A2a,B1a及B2a；用異丁酸補充發酵，結果產生天然除蟲菌素A1b,A2b,B1b及B2b；而用環戊烷羧酸補充發酵，結果產生四種新型的環戊基除蟲菌素A1,A2,B1及B2。如果用其它脂肪酸補充發酵可以產生新的除蟲菌素。通過篩選800多種潛在的前體，已經鑒定出60多種其它新的除蟲菌素(例見Dutton等，1991，抗生素雜志，44357-365；和Banks等，1994,Roy.Soc.Chem.14716-26)。此外，5-O-甲基轉移酶活性缺陷的除蟲鏈霉菌突變體實際上只能產生B類除蟲菌素，因而，同時缺少支鏈二氧酸脫氫酶及5-O-甲基轉移酶活性的除蟲鏈霉菌的突變體對應于補充發酵所用的脂肪酸僅生產出B類除蟲菌素。因此，用S-(+)-2-甲基丁酸補充該雙重突變體發酵，結果僅產生天然除蟲菌素B1a及B2a，而用異丁酸或環戊烷羧酸補充發酵則可以分別產生天然除蟲菌素B1b及B2b或新型環戊基B1及B2除蟲菌素。而用環己烷羧酸補充該雙重突變體菌是產生商業上重要的新型除蟲菌素環己基除蟲菌素B1(doramectin)的首選方法。該雙重突變體如除蟲鏈霉菌(ATCC 53692)的分離及特性描述在歐洲專利申請EP 276103中。2．2．參與除蟲菌素生物合成的基因在很多情況下，涉及次生代謝產物生產的基因及編碼一特定抗菌素的基因在染色體上的位置常常是簇集在一起的，例如，鏈霉菌聚酮化合物合成酶基因簇(PKS)(見Hopwood和Sherman,1990，遺傳學年評，2437-66)。這樣，通過生物合成途徑進行基因克隆的一個策略是分離抗藥性基因及然后檢測染色體上相鄰區域中其它與特定抗生素生物合成相關的基因。另外一種克隆重要代謝產物生物合成之相關基因的策略是突變體互補。例如，來自能產生特定代謝產物之生物的DNA文庫部分被導入不產生該代謝產物的突變體和篩選產生該代謝產物的轉化株。另外，利用來自于其它鏈霉菌的探針進行文庫雜交已被用于鑒別及克隆生物合成途徑中的基因。涉及除蟲菌素生物合成的基因(ave基因)，就象其它鏈霉菌次生代謝產物(例如，PKS)生物合成所需基因一樣，同樣簇集于染色體上。使用載體已成功克隆了許多ave基因以補充除蟲菌素生物合成受阻的除蟲鏈霉菌突變體。這些基因的克隆在美國專利5,252,474中已有描述。此外，Ikeda等，1995，抗生素雜志48532-534，描述了涉及C22,C23脫水步驟的染色體區域(aveC)定位在除蟲鏈霉菌4.82 Kb BamHⅠ酶切片斷上，并描述了產生單一組份B2a生產者的aveC基因突變。既然雙氫除蟲菌素，一潛在抗蠕蟲化合物，能由除蟲菌素B2a化學合成，該除蟲菌素B2a的單一組分生產者被認為在商業上生產雙氫除蟲菌素是比較有用的?？梢允钩x菌素生產的復雜度最小化的aveC基因突變，例如，降低除蟲菌素B2∶B1比率的突變的鑒定可以簡化商業上重要的除蟲菌素的生產及純化。3．專利技術簡述本專利技術提供了分離的多核苷酸分子，其含有除蟲鏈霉菌完整的aveC ORF基因或其實質性部分，該分離的多核苷酸分子缺少位于除蟲鏈霉菌染色體上aveC ORF所處位置下游的下一個完整的ORF。本專利技術分離的多核苷酸分子優選包括同質粒pSE 186(ATCC 209604)的除蟲鏈霉菌aveC基因產物編碼序列相同的核苷酸序列，或者同圖1(SEQ ID NO1)aveC ORF或其實質性部分相同的核苷酸序列。本專利技術進一步提供了多核苷酸分子，其具有的核苷酸序列與質粒pSE186(ATCC 209604)的除蟲鏈霉菌aveC基因產物編碼序列同源或者同圖1(SEQ ID NO1)中存在的aveC ORF的核苷酸序列或其實質性部分同源。本專利技術進一步提供了多核苷酸分子，其含有的核苷酸序列編碼的多肽的氨基酸序列與質粒pSE 186(ATCC 209604)的aveC基因產物編碼序列編碼的氨基酸序列同源或者同圖1(SEQ ID NO2)的氨基酸序列或其實質性部分同源。本專利技術進一步提供了分離的多核苷酸分子，其含有一編碼AveC同系物基因產物的核苷酸序列。在優選的實施方案中，分離的多核苷酸分子含有編碼吸水鏈霉菌AveC同系物基因產物的核苷酸序列，其中的同系物基因產物含有如SEQ ID NO4的氨基酸序列或其實質性部分。在優選的實施方案中，編碼吸水鏈霉菌AveC同系物基因產物的本專利技術分離的多核苷酸分子含有SEQ ID NO3的核苷酸序列或其實質性部分。本專利技術進一步提供了多核苷酸分子，其含有與SEQ ID NO3所示的吸水鏈霉菌核苷酸序列同源的核苷酸序列。本專利技術還提供了多核苷酸分子，其含有的核苷酸序列編碼的多肽與具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的吸水鏈霉菌AveC同系物基因產物同源。本專利技術還提供了寡核苷酸，其與具有圖1(SEQ ID NO1)或SEQ ID NO3所示核苷酸序列的多核苷酸分子雜交，或與具有圖1(SEQ ID NO1)或SEQID NO3所示核苷酸序列的互補核苷酸序列的多核苷酸分子雜交。本專利技術進一步提供了重組克隆載體及表達載體，它本文檔來自技高網...

【技術保護點】
分離的多核苷酸分子，其包含除蟲鏈霉菌完整的ａｖｅＣ ＯＲＦ或其實質性部分，該分離的多核苷酸分子缺少位于除蟲鏈霉菌染色體中ａｖｅＣ ＯＲＦ原位下游的下一個完整的ＯＲＦ。

【技術特征摘要】
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【專利技術屬性】
技術研發人員：金J施圖茨曼恩格沃爾，加藤芳弘，哈米什AI麥克阿瑟，
申請(專利權)人：輝瑞產品公司，
類型：發明
國別省市：US[美國]