本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種編碼人GM?CSF與多串連表位融合的mRNA癌癥疫苗。編碼人GM?CSF與三個串連hTERT表位融合的pVec?GM?CSF?hTes、編碼人GM?CSF與分別來自MUC1和Kras以及EGFR的三個串連表位融合的pVec?GMKE以及編碼人白細胞介素?12的pVec?hIL?12被分別構(gòu)建，并被作為模板用于產(chǎn)生相應(yīng)的體外轉(zhuǎn)錄的mRNAs，進一步被混合作為mRNA癌癥疫苗。該mRNA癌癥疫苗含有用作免疫佐劑的人GM?CSF、多個串連表位構(gòu)成的多表位癌癥抗原以及用于增強免疫治療作用的hIL?12。
A cancer vaccine encoding fusion of human GM-CSF and multiple tandem epitopes
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】一種編碼人GM-CSF與多串連表位融合的mRNA癌癥疫苗描述專利技術(shù)背景本專利技術(shù)涉及一種生物核酸mRNA疫苗，尤其是涉及一種編碼人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)與多串連表位融合的mRNA癌癥疫苗。通過刺激免疫系統(tǒng)來抗現(xiàn)有癌癥的治療性癌癥疫苗是治療癌癥的最有效的藥物，這是因為癌癥疫苗可引起機體的免疫應(yīng)答并產(chǎn)生免疫記憶。確保癌癥疫苗成功的第一步是癌癥疫苗的抗原設(shè)計。用于癌癥疫苗的大多數(shù)抗原是腫瘤相關(guān)抗原(tumor-associatedantigens，TAAs)，例如人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscriptase，hTERT)、粘蛋白1(mucin1，MUC1)、Kras和表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)等。端粒位于真核染色體的末端，是由串連重復(fù)非轉(zhuǎn)錄DNA序列(TTAGGG)和端粒結(jié)合蛋白組成的特殊“帽”結(jié)構(gòu)。端粒的作用是維持染色體完整性和控制細胞分裂周期。染色體的端粒隨著每次連續(xù)的細胞分裂而變短。當端粒收縮到一定程度時，細胞停止分裂并處于靜止狀態(tài)。端粒酶能夠添加TTAGGG重復(fù)序列到染色體的末端。人端粒酶催化亞基為人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscriptase，hTERT)，其活性在正常細胞中被抑制，并且太低而不能被檢測到。然而，在生殖細胞和干細胞中，特別是在大多數(shù)腫瘤細胞中(大于85％)，hTERT被激活并且能夠大量表達。因此，hTERT是癌癥治療的理想靶標。應(yīng)用pGX0001，構(gòu)建了編碼含有兩個突變位點的hTERT的phTERTDNA疫苗。證明電穿孔到體內(nèi)的phTERTDNA疫苗可在動物體內(nèi)打破免疫耐受并誘導(dǎo)各種強的細胞毒性應(yīng)答[YanJ，etal.CancerImmunolRes.2013；1(3)：179-89]。將構(gòu)建的pGEM4Z/hTERT/A64和pGEM4Z/hTERT/LAMP/A64作為模板用于產(chǎn)生體外轉(zhuǎn)錄的mRNA，并被分別電穿孔轉(zhuǎn)染到樹突狀細胞(dendriticcells，DC)。將DC-mRNA疫苗皮內(nèi)接種到患有轉(zhuǎn)移性前列腺癌的患者中。結(jié)果顯示嵌合LAMP-hTERT疫苗可引起比未修飾的hTERT疫苗顯著更高頻率的hTERT特異性CD4+T細胞[SuZ，etal.JImmunol.2005；174(6)：3798-807]。編碼hTERT基因的腺病毒疫苗(Ad-hTERT)可以引發(fā)靶向自體腫瘤細胞的強的CD8+細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)應(yīng)答，然而用于人體的腺病毒載體可能引起顯著的副作用。此外，完整TAA能夠引起強的抗癌免疫應(yīng)答，但亦可能誘導(dǎo)免疫耐受或自身免疫應(yīng)答。hTERTI540-548(ILAKFLHWL)是用于黑色素瘤免疫治療的第一個hTERT表位疫苗，并已進入III期臨床試驗[LiuJP，etal.BiochimBiophysActa.2010；1805(1)：35-42]。由hTERT蛋白殘基611-626片段組成的16個氨基酸的hTERT多肽疫苗GV1001可以在癌癥患者中引發(fā)廣泛的抗hTERTCD4+T細胞應(yīng)答[Inderberg-SusoEM，etal.Oncoimmunology2012；1(5)：670-686]。將包含hTERT540-548、hTERT572Y-580和hTERT865-873四聚體多抗原肽(multipleantigenpeptides，MAP)的合成疫苗接種到動物中可以引發(fā)強的hTERT特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應(yīng)[LiaoZL，etal.CancerSci.2012；103(11)：1920-8]。將含有hTERTI540多肽(ILAKFLHWL)、hTERTR572Y多肽(YLFFYRKSV)、hTERTD988Y多肽(YLQVNSLQTV)、存活蛋白(survivin)Sur1M2多肽(LMLGEFLKL)和巨細胞病毒對照多肽N495(NLVPMVATV)的疫苗接種到移植自體干細胞的骨髓瘤患者后，能夠引起強的T細胞恢復(fù)和持續(xù)減少調(diào)節(jié)性T細胞(regulatoryTcells，Treg)[RapoportAP，etal.Blood2011；117(3)：788-97]。hTERT多肽疫苗例如GV1001疫苗在癌癥治療的一些臨床試驗中已經(jīng)顯示出有希望的結(jié)果，但是仍然不能在患有皮膚T細胞淋巴瘤的患者中誘導(dǎo)抗癌反應(yīng)[SchlapbachC，etal.JDermatolSci.2011；62(2)：75-83]。此外，GV1001疫苗用于在化療期間的胰腺癌患者不能改善患者的整體存活[MiddletonG，etal.LancetOncol.2014；15(8)：829-40]。粘蛋白1(Mucin1，MUC1)大多數(shù)是含有連接到多肽核心的O-糖苷鍵的I型跨膜蛋白。在正常情況下，MUC1主要表達于腔上皮細胞或許多組織和器官的腺表面，呈現(xiàn)在上皮細胞的頂端表面。由于其在80-90％的腫瘤組織中的異常表達，因此MUC1成為抗癌治療的潛在靶標[PillaiK，etal.AmJClinOncol.2015；38(1)：108-18]。然而，用在未經(jīng)手術(shù)切除的III期非小細胞肺癌(non-smallcelllungcancer，NSCLC)患者中的免疫治療用MUC1(氨基酸殘基130-154)多肽疫苗tecemotide未能在臨床試驗中改善NSCLC患者的存活[ButtsC，etal.LancetOncol.2014；15(1)：59-68]。也許由單一腫瘤相關(guān)抗原(TAA)例如MUC1組成的疫苗用于NSCLC患者的免疫治療可能是無效的[XiaW，etal.JThoracDis.2014；6(10)：1513-20]。與人類腫瘤相關(guān)的Ras基因家族包括Hras、Kras和Nras。其中，Kras對人類癌癥有很大的影響，它就像身體的一個“開關(guān)”。在正常情況下，Kras可以調(diào)節(jié)細胞生長；在異常情況下，Kras引起細胞的連續(xù)生長并阻止細胞的自我毀壞。目前，一些靶向Kras的化療藥物已經(jīng)進入臨床使用，但這些藥物易于耐藥。一種潛在的方法是通過疫苗接種來治療癌癥。證明含有來自PANC細胞的完整抗原(具有Kras點突變)的樹突細胞(DC)疫苗可以誘導(dǎo)良好的抗癌免疫應(yīng)答，但是含有正常細胞組份的疫苗可能引起免疫耐受和自身免疫應(yīng)答[TanG，etal.OncolRep.2011；26(1)：215-21]。用Kras(12Val)突變多肽脈沖的DC疫苗可以促進成熟DC表面分子的表達并增強細胞毒性T淋巴細胞(CTL)應(yīng)答，但不能實現(xiàn)強的抗癌免疫效果。因此，上述Kras(12Val)突變多肽脈沖的DC疫苗仍需要改進。表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)是表皮生長因子(EGF)的受體。EGFR在正常上皮細胞的表面表達并在一些腫瘤細胞中異常表達。EGFR的過表達與腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、侵襲和預(yù)后不良有關(guān)。EGFR-酪氨酸激酶抑制劑如gefitinib和erlotinib用于具有EGFR突變的NSCLC患者，已證明其具有本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
1.一種mRNA癌癥疫苗，包括：a.GM?CSF?hTes?mRNA；b.GMKE?mRNA；和c.人白細胞介素?12(hIL?12)mRNA。
【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】1.一種mRNA癌癥疫苗，包括：a.GM-CSF-hTesmRNA；b.GMKEmRNA；和c.人白細胞介素-12(hIL-12)mRNA。2.權(quán)利要求1的GM-CSF-hTesmRNA，其中GM-CSF-hTesmRNA是以pVec-GM-CSF-hTes作為模板和通過體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的。3.權(quán)利要求2的pVec-GM-CSF-hTes，其中pVec-GM-CSF-hTes編碼人GM-CSF與三個串連hTERT表位融合基因，包括GM-CSF(無終止密碼子)-接頭-HindIII-hTERT(I540-548)-11aa-hTERT(572Y-580)-2aa-hTERT(988Y-997)即GM-CSF-hTes。4.權(quán)利要求2的pVec-GM-CSF-hTes，其中用于PCR擴增和獲得人GM-CSF(無終止密碼子)的反向引物的核苷酸序列與SEQIDNO：3相同或至少53％相同。5.權(quán)利要求2的pVec-GM-CSF-hTes，其中用于PCR擴增并獲得hTERT(I540-548)-11aa-hTERT(572Y-580)-2aa-hTERT(988Y-997)的正向引物的核苷酸序列與SEQIDNO：16相同或至少69％相同。6.權(quán)利要求2的pVec-GM-CSF-hTes，其中用于PCR擴增并獲得hTERT(I540-548)-11aa-hTERT(572Y-580)-2aa-hTERT(988Y-997)的反向引物的核苷酸序列與SEQIDNO：17相同或至少68％相同。7.權(quán)利要求2的pVec-GM-CSF-hTes，其中hTERT(I540-548)-11aa-hTERT(572Y-580)-2aa-hTERT(988Y-997)的氨基酸序列與SEQIDNO：8相同或至少64％相同。8.權(quán)利要求2的pVec-GM-CSF-hTes，其中hTERT(I540-548)-11aa-hTERT(572Y-580)-2aa-hTERT(988Y-997)的核苷酸...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：丁恩雨，
申請(專利權(quán))人：丁恩雨，
類型：發(fā)明
國別省市：美國,US
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