全細胞疫苗制造技術

本公開涉及表達聚糖和糖綴合物抗原的減毒細菌細胞及其在制造有效預防或治療非人類物種中的細菌感染的全細胞疫苗中的用途。

Whole cell vaccine

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】全細胞疫苗專利
本公開涉及表達聚糖和糖綴合物抗原的減毒細菌細胞及其在制造有效引發非人類動物物種中的免疫應答以及預防或治療細菌感染的全細胞疫苗或免疫原性組合物中的用途。專利技術背景由于動物產品需求的增長，動物健康面臨著新的和額外的挑戰。盡管降低了動物生長和生產的成本，但數百只動物(諸如豬、牛或雞)的限制和收容顯著增加了疾病的發生率和傳播。動物疾病不僅與經濟風險(諸如生產力損失、市場破壞或農民的生計風險)相關，還具有人類健康風險的影響。維持健康的牲畜對于經濟和社會的繁榮至關重要，然而，疫苗在獸醫學中的應用和發展尚不成熟，主要是因為必須降低動物接種疫苗的成本并且因為我們對導致動物疾病的病原體的認識并不像對感染人類的那些病原體的認識一樣先進。例如，糖綴合物疫苗在人類中廣泛使用；然而，由于它們開發成本仍然很高，獸醫應用受到限制。致病性細菌是影響動物的傳染病的主要原因。在農業上重要的動物物種中控制細菌感染是有問題的，因為動物彼此非常接近，這可以促進整個畜群中感染的散播。當較大比例的動物對特定感染因子免疫時，畜群免疫力存在，但是一旦大量非免疫動物存在于畜群中時畜群免疫力可能會被破壞。為了實現畜群免疫力，有必要持續監測動物的畜群易感性成員以控制傳播。細菌傳播的控制是通過許多措施來實施的，這些措施是勞動密集的以及實施起來很昂貴，并且包括隔離檢疫；消除動物感染庫；環境控制[即維持清潔水和食物供應，衛生處理排泄物，空氣衛生]；使用抗生素；使用益生菌來增強非致病性細菌的生長，和抑制致病性細菌的生長以及主動免疫以增加畜群的抗性成員的數量。通常對細菌感染具有抗性的畜群的產生需要鑒定形成誘導免疫力的疫苗基礎的抗原。此外，動物物種攜帶也會感染人類的細菌病原體。動物傳染病是一種從非人類動物可傳播給人類的傳染病。由革蘭氏陰性細菌導致的動物傳染病的細菌感染的實例包括：從受細菌污染的奶和肉傳播到人類的由布魯氏菌(Brucellaspp)導致的布魯氏菌病；由彎曲桿菌(Campylobacterspp)導致的彎曲桿菌病；由霍亂弧菌導致的霍亂；由來自受細菌污染的未煮過的肉和未經高溫消毒的奶的耶爾森氏菌(Yersinaspp)導致的耶爾森氏菌病；以及由來自受細菌污染的肉、特別是豬肉和蛋的沙門氏菌(Salmonellaspp)導致的沙門氏菌病。有由各種細菌引起的各種各樣的疾病(例如雞的大腸桿菌病、奶牛的乳腺炎或豬的呼吸系統疾病)可以影響牲畜。一旦感染發生，治療選擇是有限的，通常依賴于昂貴的抗生素，并且更重要的是它們的重復使用促成抗性的發展。因此，保護性疫苗接種是優選的方法，通常預防并有助于根除非人類動物疾病。成功疫苗的定義性特征是能夠以最小的副作用引起持久的保護性免疫應答。大多數獸用疫苗都是基于活的減毒細菌菌株或不含抗原活性組分的產品，諸如滅活的全細胞疫苗或僅含有病原體的抗原性部分的亞單位疫苗(基于蛋白質或碳水化合物亞基、重組蛋白、肽或基于核酸的產品)。包含碳水化合物特異性抗原的糖綴合物疫苗可以提供針對多種致病性細菌的保護。然而，糖綴合物疫苗通常遭受低免疫原性并且不能產生足夠的記憶B淋巴細胞細胞應答。多糖抗原與蛋白質載體的偶聯產生的糖綴合物顯著增加免疫原性。目前許可的人糖綴合物疫苗包括針對流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)、腦膜炎奈瑟氏菌(Neisserriameningitidis)和肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)的那些糖綴合物疫苗，其包含與載體蛋白化學結合的細菌多糖。流感嗜血桿菌B型(Hib)疫苗或(針對由肺炎鏈球菌引起的疾病有保護作用的13價基于莢膜的糖綴合物疫苗)使用載體蛋白iCRM197(從白喉棒狀桿菌(Corynebacteriumdiphtheria)中分離出來的無毒形式的白喉毒素)。這些糖綴合物疫苗是有效的，但它們的生產需要從天然病原體中純化多糖聚糖并且將多糖與合適的蛋白質載體化學偶聯，這是一種高成本，低效和耗時的過程。從細菌來源獲得或通過化學合成獲得聚糖。載體蛋白通常是細菌毒素如破傷風和白喉(最常見的是重組形式，CRM197)，盡管已經使用了其它載體。例如，鑰孔血藍蛋白(KLH)已經經常被用于動物疫苗研究。聚糖與載體蛋白的偶聯需要聚糖和/或載體的化學活化，這通常需要幾個步驟并產生異源性產物。包含能夠將抗原性多糖聚糖轉移到蛋白質載體上的寡糖轉移酶的修飾細菌菌株的使用為糖綴合物的生產提供了經濟的可替代方法，并且是本領域已知的。在WO2009/104074或WO2014/114926中公開了在細菌表達系統中用于人用的糖綴合物疫苗的產生。在細菌表達系統中產生糖綴合物需要三個基因的共表達：受體蛋白質、多糖生物合成基因座以及用于偶聯反應的寡糖轉移酶。然而，僅在一個宿主中共表達通常導致次優的產量，這使其商業化不可行。本公開使用聚糖偶聯技術，以通過引入編碼抗原性多糖、寡糖轉移酶和受體蛋白的轉錄盒作為質粒的一部分或直接插入基因組，來在活的減毒全細胞疫苗中表達一種或多種致病性細菌的抗原性多糖，從而增加它們對多種病原體的保護譜。此外，還公開了具有降低的翻譯效率的重組表達系統，其包含寡糖轉移酶、毒性載體蛋白或編碼聚糖生物合成所需蛋白質的基因。通過提供核糖體結合位點[RBS]與翻譯起始密碼子之間的距離增加的載體來降低翻譯效率，從而使細菌生長到高密度并避免在對細菌細胞有毒的濃度下表達重組蛋白的有害影響。
技術實現思路
根據本專利技術的一方面，提供了致病性細菌細胞，其中所述細胞轉化了包含生物合成基因座的轉錄盒，所述生物合成基因座包含并非由所述轉化的致病性細菌細胞表達的異源性聚糖抗原合成所需的一種或多種多肽，其中所述異源聚糖抗原在細菌細胞表面處被表達。根據本專利技術的一方面，提供了致病性細菌細胞，其中所述細胞轉化了一種或多種轉錄盒，所述一種或多種轉錄盒包含：核酸分子，其編碼寡糖轉移酶多肽，核酸分子，其編碼作為所述寡糖轉移酶的底物的包含至少一個糖基化位點的一種或多種載體多肽，和核酸分子，其編碼生物合成基因座，所述生物合成基因座包含并非由所述轉化的致病性細菌細胞表達的異源聚糖抗原合成所需的一種或多種多肽，特征在于所述致病性細菌細胞是減毒的并且所述異源聚糖抗原在所述細菌細胞表面處被表達，并且其中所述異源聚糖還被偶聯至所述載體多肽以提供保留在所述減毒的致病性細菌細胞內的糖綴合物。在本專利技術另一優選的實施方案中，所述細菌細胞包含至少一個編碼膜多肽或膜相關多肽的失活的或經突變的基因，其中活的致病性細菌細胞是減毒的并且所述減毒是所述基因失活或突變的結果。在本專利技術優選的實施方案中，至少2、3或更多個基因是失活的或經突變的。在本專利技術優選的實施方案中，所述基因選自：編碼分選酶的基因和/或編碼多糖修飾酶的基因，其中所述修飾與所述分選酶或多糖修飾基因的表達的失活或抑制相關。在本專利技術優選的實施方案中，編碼所述分選酶的基因由選自以下的核苷酸序列編碼：i)核酸分子，其包含如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；ii)核酸分子，其包含其中所述序列對于(i)中所限定的核苷酸序列是遺傳密碼簡并的結果的核苷酸序列，；和iii)核酸分子，其互補鏈在嚴格雜交條件下雜交與上述i)和ii)中的核苷酸序列雜交，其中所述核酸分子編碼分選酶。在本專利技術優選的實施方案中，本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.致病性細菌細胞，其中所述細胞轉化了一個或多個轉錄盒，所述一個或多個轉錄盒包含：核酸分子，其編碼寡糖轉移酶多肽，核酸分子，其編碼作為所述寡糖轉移酶的底物的包含至少一個糖基化位點的一種或多種載體多肽，和核酸分子，其編碼生物合成基因座，所述生物合成基因座包含并非由所述轉化的致病性細菌細胞表達的異源聚糖抗原合成所需的一種或多種多肽，特征在于所述致病性細菌細胞是減毒的并且所述異源聚糖抗原在所述細菌細胞表面處被表達，并且其中所述異源聚糖還被偶聯至所述載體多肽以提供保留在所述減毒的致病性細菌細胞內的糖綴合物。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2017.03.15 GB 1704108.8;2017.03.15 GB 1704103.91.致病性細菌細胞，其中所述細胞轉化了一個或多個轉錄盒，所述一個或多個轉錄盒包含：核酸分子，其編碼寡糖轉移酶多肽，核酸分子，其編碼作為所述寡糖轉移酶的底物的包含至少一個糖基化位點的一種或多種載體多肽，和核酸分子，其編碼生物合成基因座，所述生物合成基因座包含并非由所述轉化的致病性細菌細胞表達的異源聚糖抗原合成所需的一種或多種多肽，特征在于所述致病性細菌細胞是減毒的并且所述異源聚糖抗原在所述細菌細胞表面處被表達，并且其中所述異源聚糖還被偶聯至所述載體多肽以提供保留在所述減毒的致病性細菌細胞內的糖綴合物。2.根據權利要求1所述的致病性細菌細胞，其中所述細菌細胞包含至少一個編碼膜多肽或膜相關多肽的失活的或經突變的基因，其中活的致病性細菌細胞是減毒的并且所述減毒是所述基因失活或突變的結果。3.根據權利要求1或2所述的致病性細菌細胞，其中所述基因選自：編碼分選酶的基因和/或編碼多糖修飾酶的基因，其中所述修飾與所述分選酶或多糖修飾基因的表達的失活或抑制相關。4.根據權利要求3所述的致病性細菌細胞，其中編碼所述分選酶的基因由選自以下的核苷酸序列編碼：i)核酸分子，其包含如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；ii)核酸分子，其包含其中所述序列對于(i)中所限定的核苷酸序列是遺傳密碼簡并的結果的核苷酸序列，；和iii)核酸分子，其互補鏈在嚴格雜交條件下雜交與上述i)和ii)中的核苷酸序列雜交，其中所述核酸分子編碼分選酶。5.根據權利要求3所述的致病性細菌細胞，其中編碼所述分選酶的基因由選自以下的核苷酸序列編碼：i)核酸分子，其包含如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列的；ii)核酸分子，其包含其中所述序列對于(i)中所限定的核苷酸序列是遺傳密碼簡并的結果的核苷酸序列；和iii)核酸分子，其互補鏈在嚴格雜交條件下與上述i)和ii)中的核苷酸序列雜交，其中所述核酸分子編碼分選酶。6.根據權利要求3所述的致病性細菌細胞，其中編碼所述多糖修飾酶的基因由選自以下的核苷酸序列編碼：i)核酸分子，其包含如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列；ii)核酸分子，其包含其中所述序列對于(i)中所限定的核苷酸序列是遺傳密碼簡并的結果的核苷酸序列；和ii)核酸分子，其互補鏈在嚴格雜交條件下與上述i)和ii)中的核苷酸序列雜交，其中所述核酸分子編碼多糖修飾酶。7.根據權利要求3至6中任一項所述的致病性細菌細胞，其中編碼所述分選酶和/或所述多糖修飾酶的所述基因通過編碼所述分選酶和/或多糖修飾酶的核苷酸序列的全部或部分的缺失，或者控制所述分選酶和/或多糖修飾酶的表達的調節區的全部或部分的缺失而被修飾。8.根據權利要求1至7中任一項所述的致病性細菌細胞，其中所述寡糖轉移酶是彎曲桿菌屬寡糖轉移酶。9.根據權利要求8所述的致病性細菌細胞，其中所述彎曲桿菌屬寡糖轉移酶是空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)寡糖轉移酶。10.根據權利要求8所述的致病性細菌細胞，其中所述彎曲桿菌屬寡糖轉移酶是生痰彎曲桿菌(Campylobactersputorum)寡糖轉移酶。11.根據權利要求9所述的致病性細菌細胞，其中所述寡糖轉移酶由包含如SEQIDNO:4所示的核苷酸序列的核酸分子編碼，或者由包含與SEQIDNO:4所示的全長核苷酸序列具有至少50％核苷酸序列同一性的核苷酸序列的核酸分子編碼。12.根據權利要求10所述的致病性細菌細胞，其中所述寡糖轉移酶由包含如SEQIDNO:5或6所示的核苷酸序列的核酸分子編碼，或者由包含與SEQIDNO:5或6所示的全長核苷酸序列具有至少50％核苷酸序列同一性的核苷酸序列的核酸分子編碼。13.根據權利要求9或11所述的致病性細菌細胞，其中所述寡糖轉移酶由SEQIDNO:7所示的氨基酸序列表示，或者由與SEQIDNO:7所示的全長氨基酸序列至少50％相同的氨基酸序列表示。14.根據權利要求10或12所述的致病性細菌細胞，其中所述寡糖轉移酶由SEQIDNO:8所示的氨基酸序列表示，或者由與SEQIDNO:8所示的全長氨基酸序列至少50％相同的氨基酸序列表示。15.根據權利要求1至14中任一項所述的致病性細菌細胞，其中所述載體多肽包含氨基酸基序：Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸，或其中所述受體多肽包括氨基酸基序：D/E-X-N-X-S/T，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。16.根據權利要求1至15中任一項所述的致病性細菌細胞，其中,所述載體多肽是由所述減毒的致病性細菌細胞的基因組編碼的內源性載體多肽。17.根據權利要求1至16中任一項所述的致病性細菌細胞，其中所述載體多肽是由不是由所述減毒的致病性細菌細胞天然表達的核酸分子編碼的異源性載體多肽。18.根據權利要求17所述的致病性細菌細胞，其中所述異源性載體多肽由從致病性細菌物種分離的核酸分子編碼。19.根據權利要求17或18所述的致病性細菌細胞，其中所述異源性載體多肽由如SEQIDNO:9、10或11所示的核苷酸序列編碼。20.根據權利要求1至19中任一項所述的致病性細菌細胞，其中編碼包含異源聚糖抗原合成所需的一種或多種多肽的生物合成基因座的所述核酸分子，編碼莢膜多糖。21.根據權利要求20所述的致病性細菌細胞，其中所述多糖是O-抗原。22.根據權利要求20所述的致病性細菌細胞，其中所述多糖是七糖。23.根據權利要求20所述的致病性細菌細胞，其中所述生物合成基因座包含含有如SEQIDNO:12所示的核苷酸序列的核酸分子。24.根據權利要求1至23中任一項所述的致病性細菌細胞，其中編碼所述寡糖轉移酶的所述核酸分子穩定地整合至所述減毒的致病性細菌細胞的基因組中。25.根據權利要求1至24中任一項所述的致病性細菌細胞，其中編碼所述載體多肽的所述核酸分子穩定地整合至所述減毒的致病性細菌細胞的基因組中。26.根據權利要求1至25中任一項所述的致病性細菌細胞，其中編碼所述生物合成基因座的所述核酸分子穩定地整合至所述減毒的致病性細菌細胞的基因組中。27.根據權利要求1至26中任一項所述的致病性細菌細胞，其中所述生物合成基因座是Pgl基因座。28.根據權利要求27所述的致病性細菌細胞，其中所述Pgl基因座包含編碼選自以下的所述一種或多種多肽的基因：PglG、PglF、PglE、Cj1122c、PglD、PglC、PglA、PglJ、PglI、PglH、PglK。...

【專利技術屬性】
技術研發人員：喬恩·庫崔，布倫丹·雷恩，亞歷山德拉·福爾茲佩恩，
申請(專利權)人：倫敦衛生及熱帶醫學學院，
類型：發明
國別省市：英國,GB