桿狀病毒載體制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及用于將基因插入到桿狀病毒序列的基因座中的轉(zhuǎn)移載體。所述轉(zhuǎn)移載體包括表達(dá)框，該表達(dá)框包括與基因可操作地連接的真核啟動(dòng)子，和雙向選擇框。本發(fā)明專利技術(shù)還涉及使用該轉(zhuǎn)移載體及衍生的桿粒和桿狀病毒的方法。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】桿狀病毒載體本專利技術(shù)涉及用于將基因插入到桿狀病毒序列的基因座中的轉(zhuǎn)移載體。本專利技術(shù)還涉及使用轉(zhuǎn)移載體和衍生的桿粒和桿狀病毒的方法。已經(jīng)將桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)用于在真核細(xì)胞中表達(dá)數(shù)以千計(jì)的蛋白質(zhì)用于結(jié)構(gòu)和生物化學(xué)研究(14)。除了表達(dá)單個(gè)重組蛋白的能力之外，桿狀病毒系統(tǒng)也已用于共同表達(dá)形成復(fù)合物的多種蛋白(15-22)。這一點(diǎn)是重要的，因?yàn)榛蚪M范圍內(nèi)的相互作用的篩選揭示了活細(xì)胞的多種關(guān)鍵功能是由多亞基蛋白復(fù)合物完成的(23)。已經(jīng)使用了兩種主要的策略利用桿狀病毒系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的共表達(dá)。使用各自表達(dá)一種重組蛋白的兩種或者多種病毒共感染細(xì)胞是目前為止最常見的方法(19，24，25)。然而，這些研究中蛋白質(zhì)復(fù)合物的產(chǎn)率通常變化很大并且由兩種不同的桿狀病毒共感染相同的細(xì)胞不滿足泊松分布(poisson distribution) (26)。因此，盡管共感染方法在技術(shù)上簡(jiǎn)單，但在實(shí)踐中其僅限于相對(duì)簡(jiǎn)單的復(fù)合物的回收，用于不需要大量純化蛋白的應(yīng)用。對(duì)于例如結(jié)構(gòu)研究和需要多種蛋白質(zhì)的大規(guī)模的疫苗試驗(yàn)的應(yīng)用而言，以及對(duì)于由多個(gè)亞基形成的更加復(fù)雜的復(fù)合物而言，使用了共表達(dá)來自插入到多角體蛋白或者PlO 位置的多個(gè)類似表達(dá)框中的的蛋白質(zhì)的可選方法(15-18，22，27)。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于在培養(yǎng)物中的每一個(gè)被重組病毒感染的細(xì)胞都以可再生的方式表達(dá)形成蛋白質(zhì)復(fù)合物所需要的蛋白質(zhì)。將共感染和單獨(dú)桿狀病毒方法進(jìn)行比較時(shí)，單獨(dú)桿狀病毒方法證明具有顯著更高的重組復(fù)合物產(chǎn)率(28)。然而，使用單獨(dú)的重組病毒表達(dá)多種蛋白質(zhì)并不是沒有缺點(diǎn)。 盡管棒狀的桿狀病毒看起來似乎對(duì)于其基因組中的插入相當(dāng)有耐受力，但基因是通過同源重組轉(zhuǎn)移到病毒，同時(shí)轉(zhuǎn)移載體的尺寸必須容易在大腸桿菌中操作。因此，對(duì)于能插入到轉(zhuǎn)移載體中的基因的數(shù)目有限制。在實(shí)踐中，這意味著不大可能表達(dá)來自單個(gè)座位上的多于4 種的蛋白質(zhì)。除此之外，桿狀病毒含有表達(dá)蛋白質(zhì)的序列，該蛋白質(zhì)促進(jìn)同源重組(29-32)。 因此，含有大量重復(fù)序列的病毒容易發(fā)生重排和重組(21，33，34)。通過在桿粒的chiA/cath印sin基因座插入IoxP位點(diǎn)，修改了單獨(dú)桿狀病毒共表達(dá)的方法，所述的桿粒已經(jīng)在多角體蛋白基因座上含有Tn7的靶點(diǎn)(20)。這使得通過在大腸桿菌中的重組在這些基因座的每一個(gè)中插入多個(gè)表達(dá)框。正如假定這個(gè)系統(tǒng)依賴于經(jīng)過修飾以表達(dá)不同基因的表達(dá)框的重復(fù)復(fù)制所預(yù)料的那樣，有證據(jù)顯示插入到該系統(tǒng)中在某種程度上在遺傳上不穩(wěn)定(21)。最近的桿狀病毒研究受益于ET重組系統(tǒng)的使用，該重組系統(tǒng)使得能夠選擇性地敲除病毒的基因(35-49)。然而，還未檢驗(yàn)這種技術(shù)改造和促進(jìn)在PlO和多角體蛋白之外的基因座上表達(dá)蛋白的潛力。本專利技術(shù)涉及從單個(gè)的桿狀病毒基因組中有效地表達(dá)多種重組蛋白質(zhì)(即桿狀病毒蛋白質(zhì))的方法。該方法使得能夠使用ET重組系統(tǒng)在病毒基因組內(nèi)的不同基因座上有效地插入單個(gè)的蛋白質(zhì)表達(dá)框。除此之外，該方法使得能表達(dá)具有多個(gè)亞基的復(fù)合物。已經(jīng)完善地建立了使用桿狀病毒作為表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)單個(gè)的蛋白質(zhì)。該表達(dá)系統(tǒng)的基本方法學(xué)自從其首次產(chǎn)生以來變化很小。到133kb時(shí)桿狀病毒的dsDNA太大無法直接操作。因此將編碼外來蛋白質(zhì)的基因在大腸桿菌中克隆到含有來自AcMNPV昆蟲病毒的表達(dá)框的載體中，隨后將其與病毒DNA —起引入到昆蟲細(xì)胞中，在昆蟲細(xì)胞中病毒和細(xì)胞的蛋白質(zhì)介導(dǎo)同源重組，導(dǎo)致表達(dá)外源蛋白質(zhì)的感染性(相對(duì)于昆蟲細(xì)胞)病毒的產(chǎn)生。在這一主旨下，已經(jīng)產(chǎn)生了一些變化，包括如果發(fā)生重組僅僅復(fù)制的病毒基因組(1，2)，和在大腸桿菌中使用桿粒進(jìn)行重組從而加快重組病毒的選擇，所述的桿粒基于轉(zhuǎn)位子Tn7(3)的使用。通過使用以上簡(jiǎn)述的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，還實(shí)現(xiàn)了多蛋白復(fù)合體在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)。最初使用各自表達(dá)單一蛋白質(zhì)的多種病毒共感染易感細(xì)胞和在表達(dá)之后純化的蛋白質(zhì)復(fù)合物。然而，這充其量也沒有效力并且重復(fù)性不足以用于擴(kuò)大規(guī)模。作為選擇，生產(chǎn)了將多個(gè)表達(dá)單元整合但是與單個(gè)的病毒基因座重組的載體(4-6)。這些載體的優(yōu)點(diǎn)在于它們?cè)诿恳粋€(gè)受感染的細(xì)胞中生產(chǎn)全部的重組蛋白亞基，并導(dǎo)致顯著更高的重組蛋白復(fù)合物的產(chǎn)率。除此之外，由于僅有一種病毒表達(dá)所有的蛋白，感染的結(jié)果更加具有可重復(fù)性。這些載體的缺點(diǎn)是雙重的。首先，該載體含有重復(fù)的序列，并且所述的桿狀病毒表達(dá)促進(jìn)同源組合、表達(dá)的蛋白質(zhì)，尤其是來自含有三個(gè)或者四個(gè)表達(dá)單元的蛋白質(zhì)，并且所述的蛋白質(zhì)通過大量的病毒傳代(其在工業(yè)規(guī)模中對(duì)于桿狀病毒蛋白質(zhì)表達(dá)是必要的)并不總是在遺傳上非常穩(wěn)定。第二，實(shí)踐中對(duì)于可以在大腸桿菌中容易保持和操作的插入物的大小有限制， 限制了可以從這些載體中表達(dá)的蛋白質(zhì)的數(shù)目。為了生產(chǎn)多種蛋白質(zhì)，提出的另一種方法是在桿狀病毒的一個(gè)基因座上插入外來蛋白質(zhì)，隨后選擇表達(dá)該蛋白的病毒，并使用該病毒基因組在第二個(gè)基因座上重組，從而表達(dá)其他的蛋白質(zhì)(7)。然而，由于在此方法中涉及的高水平的技術(shù)技能和時(shí)間的量(第一個(gè)座位16天以及各個(gè)隨后的座位各25天)，這種方法基本未曾使用。最近的開發(fā)旨在修飾基于BAC的Τη7轉(zhuǎn)位子，以便在桿狀病毒的第二個(gè)基因座中插入LoxP位點(diǎn)，從而使得能在大腸桿菌中的該座位上插入額外的基因(8)。然而， 本方法仍然存在下述問題，即在細(xì)菌載體中來自啟動(dòng)子的復(fù)制的重復(fù)序列意味著對(duì)于多個(gè)病毒傳代而言，該構(gòu)建物在遺傳上不穩(wěn)定，并且轉(zhuǎn)移載體會(huì)迅速地達(dá)到在大腸桿菌中操作的最大實(shí)際尺寸。本專利技術(shù)的方法克服了現(xiàn)有方法中固有的至少一些問題，例如遺傳不穩(wěn)定性，以及對(duì)多輪重組的需要。根據(jù)第一個(gè)方面，本專利技術(shù)提供了用于將基因插入到桿狀病毒序列的基因座中的轉(zhuǎn)移載體，該轉(zhuǎn)移載體包括表達(dá)框，所述表達(dá)框包括與基因可操作地連接的真核啟動(dòng)子；雙向選擇框，該雙向選擇框包括(i)編碼第一個(gè)選擇標(biāo)記的可表達(dá)序列；和(ii)編碼第二個(gè)選擇標(biāo)記的可表達(dá)序列；和位于表達(dá)和雙向選擇框側(cè)翼的序列，其中所述的序列大體上對(duì)應(yīng)于桿狀病毒序列中基因座的序列。本專利技術(shù)的轉(zhuǎn)移載體可以用于將基因有效地插入到桿狀病毒序列的基因座中，并選擇包含該基因的桿狀病毒序列。特別地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與使用單個(gè)選擇標(biāo)記相比，通過使用雙向選擇框，陽性克隆(即含有所插入的基因的桿狀病毒序列)的鑒定獲得了大幅度增加。這與使用單個(gè)的選擇標(biāo)記相比，具有顯著優(yōu)勢(shì)。僅有少量的桿狀病毒被轉(zhuǎn)化，所以標(biāo)記僅僅以很低的水平表達(dá)。例如，如果該標(biāo)記具有抗生素抗性，則只能使用非常低水平的抗生素。這導(dǎo)致了對(duì)細(xì)菌變體的選擇，該細(xì)菌變體對(duì)于所使用的抗生素具有抗性。因此，一些在平板上生長(zhǎng)的細(xì)菌可以不含有修飾。使用兩種陽性選擇方法克服該假陽性的選擇。本專利技術(shù)的轉(zhuǎn)移載體可以是任意適用的載體，只要其能夠通過同源重組與桿狀病毒序列重組，從而將基因插入到桿狀病毒的序列中。適用的轉(zhuǎn)移載體對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是熟知的。所述的轉(zhuǎn)移載體的關(guān)鍵特征在下文中進(jìn)一步地討論。插入到桿狀病毒序列中的基因可以是任意的異源基因(即非桿狀病毒基因)。優(yōu)選的是該異源基因編碼蛋白質(zhì)復(fù)合物的亞基。所述異源基因可以編碼病毒蛋白、受體的組分或者分子伴侶復(fù)合物。尤其優(yōu)選的是，該異源基因編碼病毒蛋白，該病毒蛋白與其他的病毒蛋白一起可以形成病毒樣顆粒(VLP)。基因插入到桿狀病毒序列處的基因座可以是任意適用的基因座，本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
１．一種用于將基因插入到桿狀病毒序列的基因座中的轉(zhuǎn)移載體，所述轉(zhuǎn)移載體包括：表達(dá)框，所述表達(dá)框包括可以與基因可操作地連接的真核啟動(dòng)子；雙向選擇框，所述雙向選擇框包括：（ｉ）編碼第一個(gè)選擇標(biāo)記的可表達(dá)序列；和（ｉｉ）編碼第二個(gè)選擇標(biāo)記的可表達(dá)序列；和位于表達(dá)框和雙向選擇框側(cè)翼的序列，其中所述的序列大體上對(duì)應(yīng)于桿狀病毒序列中的基因座的序列。

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：P·羅伊，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：倫敦衛(wèi)生及熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院，
類型：發(fā)明
國別省市：GB