一種乙酰木聚糖酯酶基因、其編碼產物及制備方法技術

本發明專利技術公開了一種乙酰木聚糖酯酶基因、其編碼產物及制備方法，所述乙酰木聚糖酯酶基因命名為Est1051，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；它的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，本發明專利技術還公開了含有所述乙酰木聚糖酯酶基因的重組質粒pET28a?Est1051，本發明專利技術還公開了乙酰木聚糖酯酶的制備方法，將所述乙酰木聚糖酯酶基因Est1051在大腸桿菌原核表達系統中過量表達，該乙酰木聚糖酯酶在大腸桿菌表達體系中高效可溶性表達。同時，采用所述方法得到的乙酰木聚糖酯酶，具有較高的催化活性和熱穩定性,有很大的工業化生產和應用前景。

Acetyl xylanase gene, coding product and preparation method

【技術實現步驟摘要】
一種乙酰木聚糖酯酶基因、其編碼產物及制備方法
本專利技術涉及一種基因重組
，尤其涉及如何獲得乙酰木聚糖酯酶基因及其編碼產物的技術。
技術介紹
半纖維素是自然界中除纖維素以外最豐富的可再生生物資源。木聚糖是植物細胞壁中半纖維素的重要組成成分，約占植物細胞干重的15％-35％。這些木糖聚合物中廣泛連接乙酰基、阿拉伯糖基、阿魏酸和4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸殘基等基團，形成不同的側鏈基團，因而木聚糖具有多種多樣的結構。木聚糖側鏈上的乙酰基團的存在對木聚糖酶降解木聚糖產生了阻礙作用，進而影響底物的水解效率，產生空間障礙，限制了主鏈降解酶和主鏈的接觸，降低了可及性。乙酰木聚糖酯酶(acetylxylanesterase，AXE)可消除乙酰化木聚糖中木糖殘基C-2和C-3位的O-乙酰取代基，從而提高木聚糖酶對主鏈的可及性，改善細胞壁中木聚糖酶的水解效率。乙酰木聚糖酯酶是目前了解最少的植物細胞壁降解酶系之一。該酶在1985年首次發現之后，越來越多的不同類型的乙酰木聚糖酯酶被發現和研究。工業上降解木聚糖經常采用酸法或堿法，但酸、堿水解過程往往伴有副反應，產生較多的有毒物質，對于后期微生物發酵有抑制作用，且產生的酸、堿廢液會造成較大的環保壓力，因此，酶法降解木聚糖以其溫和環保的優勢將會成為未來木聚糖降解的主要方式。乙酰木聚糖酯酶作為半纖維素酶系成員之一具有良好的應用前景。在工程菌構建方面,乙酰木聚糖酯酶的研究對于構建產量高、協同效果優異的半纖維素酶工程菌具有重要意義。在工業應用方面,乙酰木聚糖酯酶能夠協同內切木聚糖酶和β-木糖苷酶將半纖維素徹底降解為木糖,進而轉化為木糖醇等。另外,一些乙酰木聚糖酯酶能夠作用于甲殼素的乙酰基,因此可以應用酶法制備殼聚糖,在藥物、紡織、造紙、化妝品等方面具有廣闊應用前景。目前，相對于其他木質纖維素降解酶系，對乙酰木聚糖酯酶的研究還遠遠不夠，乙酰木聚糖酯酶與其他木質纖維素降解酶系的協同作用已經得到認可，其潛在應用價值還有待開發。
技術實現思路
本專利技術的第一個目的在于提供一種乙酰木聚糖酯酶的基因及其制備方法。本專利技術的第二個目的在于提供一種乙酰木聚糖酯酶及其制備方法。本專利技術的第三個目的在于提供一種乙酰木聚糖酯酶的重組質粒pET28a-Est1051。本專利技術的第四個目的在于提供含有上述乙酰木聚糖酯酶的重組工程菌。本專利技術的第一個目的、第三個目的、第四個目的是通過如下技術方案來實現的：一種乙酰木聚糖酯酶的基因，命名為Est1051，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示：基因的制備步驟如下：(1)從樣品中提取總DNA，純化總DNA，酶切總DNA；(2)回收步驟(1)得到的酶切后的DNA片段，將DNA片段和pUC118載體連接，得到質粒；(3)將步驟(2)所得質粒轉化、文庫篩選和陽性克隆子鑒定；(4)測序，將質粒命名為pUC118-Est1051，并設計PCR引物；(5)以質粒pUC118-Est1051為模板，PCR擴增進行基因克隆；(6)將PCR產物純化，得到乙酰木聚糖酯酶基因。進一步地，所述PCR引物是：Est1051-F：CCGGAATTCCCCGTTGCGGTGTCATTATACTGAC(下劃線部分為EcoRⅠ的酶切位點)；Est1051-R：CCGCTCGAGGCTCCCGAAGAACCTATGAAACCAATTG(下劃線部分為XhoⅠ的酶切位點)。進一步地，所述步驟(5)的操作是：以質粒pUC118-Est1051為模板、Est1051-F和Est1051-R為引物，采用PrimeSTARTMMaxPremix進行Est1051基因片段的PCR擴增，體系如下：PCR的反應條件是：第一階段：95℃變性2min；第二階段：95℃變性10sec，60℃退火5sec，72℃延伸5sec，共30個循環；第三階段：72℃延伸10min，最后于4℃保存。本專利技術的第二個目的是通過如下技術方案實現的：一種乙酰木聚糖酯酶，它的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示：酶的制備方法：把權利要求1的乙酰木聚糖酯酶基因與pET-28a(+)表達載體連接，獲得連接產物重組質粒pET-28a(+)-Est1051，把重組質粒轉化到大腸桿菌BL21感受態細胞中形成重組工程菌，培養重組工程菌，破碎，得到粗酶液，純化，得到乙酰木聚糖酯酶。更詳細地，把權利要求1的乙酰木聚糖酯酶基因與pET-28a(+)表達載體連接，獲得連接產物重組質粒pET-28a(+)-Est1051，把重組質粒轉化到大腸桿菌BL21感受態細胞中形成重組工程菌，重組工程菌接種在LB液體培養基中活化，然后把活化后菌體濃度為OD600nm＝1.2的重組工程菌母液接種于另一LB液體培養基中，加入終濃度為0.8mM的IPTG，37℃培養10h，離心去上清，破碎，得到粗酶液，純化，得到乙酰木聚糖酯酶。本專利技術的有益效果：①本專利技術從實驗室前期篩選中得到一個新的乙酰木聚糖酯酶基因Est1051，Est1051為一個1051bp大小的完整乙酰木聚糖酯酶基因，利用BLAST在線比對其核苷酸序列進行同源性搜索分析表明，所述乙酰木聚糖酯酶基因Est1051與已知基因親緣性關系遠。②通過基因工程技術對該乙酰木聚糖酯酶基因做功能研究，發現該序列在大腸桿菌BL21中高效可溶表達，經蛋白純化及SDS-PAGE電泳，得到一條單一的蛋白條帶，由于pET28a載體編碼硫氧還蛋白和六聯組氨酸標簽等與目的蛋白融合表達，因此電泳中重組乙酰木聚糖酯酶的相對分子量約為50kDa.③本專利技術將SEQIDNO.1所示的DNA序列克隆到原核表達載體上，轉化入大腸桿菌BL21感受態細胞，通過對陽性克隆子的誘導表達得到重組蛋白，研究其酶學性質，結果如下：(1)在大腸桿菌表達體系中，該重組蛋白具有高效可溶性表達。(2)用對硝基苯酚乙酸酯為底物，所述乙酰木聚糖酯酶的最適反應溫度為40℃，在溫度為4～45℃之間，剩余酶活力均在50％以上，穩定性良好，表明該重組乙酰木聚糖酯酶具有耐高溫及熱穩定性方面優勢；該重組蛋白的最適反應pH為7.0，在pH5-7.5之間，剩余酶活力均在50％以上，穩定性良好；當金屬離子濃度為1mM時，Zn2+和Mn2+對酶活性有促進作用，當金屬離子濃度為10mM時，Mg2+和Fe2+對酶活性有促進作用，說明該重組酶具有較高程度的耐金屬離子特性。此外，1％的DMSO、甲醇能夠促進酶活性，但比較特殊的是隨著異丙醇和TritonX-100濃度的提高，重組乙酰木聚糖酯酶的酶活力反而提高，表明該重組乙酰木聚糖酯酶具有較高程度耐受有機溶劑的特性。附圖說明此處所說明的附圖用來提供對本專利技術的進一步理解，構成本申請的一部分，并不構成對本專利技術的不當限定，在附圖中：圖1是本專利技術實施例1乙酰木聚糖酯酶基因Est1051P本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種乙酰木聚糖酯酶基因，其特征在于：/n命名為Est1051，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技術特征摘要】
1.一種乙酰木聚糖酯酶基因，其特征在于：
命名為Est1051，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.一種如權利要求1所述的乙酰木聚糖酯酶基因編碼的乙酰木聚糖酯酶，其特征在于：
其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


3.包含權利要求1所述的乙酰木聚糖酯酶基因的重組質粒。


4.包含權利要求1所述的乙酰木聚糖酯酶基因的重組質粒pET-28a(+)-Est1051。


5.包含權利要求1所述的乙酰木聚糖酯酶基因的重組工程菌。


6.一種如權利要求1所述的乙酰木聚糖酯酶基因的制備方法，其特征在于：
步驟如下：
(1)從樣品中提取總DNA，純化總DNA，酶切總DNA；
(2)回收步驟(1)得到的酶切后的DNA片段，將DNA片段和pUC118載體連接，得到質粒；
(3)將步驟(2)所得質粒轉化、文庫篩選和陽性克隆子鑒定；
(4)測序，將質粒命名為pUC118-Est1051，并設計PCR引物；
(5)以質粒pUC118-Est1051為模板，PCR擴增進行基因克隆；
(6)將PCR產物純化，得到乙酰木聚糖酯酶基因。


7.根據權利要求6所述的乙酰木聚糖酯酶基因的制備方法，其特征在于：
所述PCR引物是：
Est1051-F：CCGGAATTCCCCGTTGCGGTGTCATTATACTGAC
(下劃線部分為EcoRⅠ的酶切位點)；
Est1051-R：CCGCTCGAGGCTCCCGAAGAACCTATGAAACCAATTG

【專利技術屬性】
技術研發人員：李荷，張夢樂，
申請(專利權)人：廣東藥科大學，
類型：發明
國別省市：廣東;44