一種檢測CSFV和PRRSV的引物組合物、試劑盒及方法技術

本發明專利技術公開了一種檢測CSFV和PRRSV的引物組合物、試劑盒及方法。本發明專利技術設計篩選出的引物組合物包括2組特異性引物和探針，在本發明專利技術優選的反應體系和反應條件下，能夠在同一反應管中同時鑒別檢測豬瘟病和豬藍耳病，具有特異性好、靈敏度高、方便快捷等特點。

A primer composition, kit and method for detecting CSFV and PRRSV

【技術實現步驟摘要】
一種檢測CSFV和PRRSV的引物組合物、試劑盒及方法
本申請涉及病毒檢測
，具體而言，涉及一種檢測CSFV和PRRSV的引物組合物、試劑盒及方法。
技術介紹
豬瘟(classicalswinefever，CSF)是由豬瘟病毒(classicalswinefeverVirus，CSFV)引起一種豬的急性和高度接觸傳染性疾病，以高熱、皮下出血、脾梗死為特征，死亡率極高。該病在我國流行已有幾十年的歷史，一直以來我國對該病采取了很多嚴格的防疫措施,包括豬瘟疫苗的應用等等，極大地控制了豬瘟的廣泛流行,但是目前該病在我國以及世界許多養豬國家依然存在。豬繁殖與呼吸障礙綜合癥(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸障礙綜合癥病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromeviruses，PRRSV)引起的一種豬急性傳染病，俗稱豬藍耳病，病豬表現為食欲不振，體溫升高，以耳根和腹部發紅為明顯特征，發病率和死亡率極高，該病對豬的危害性極大，引起極大的經濟損失。豬瘟(classicalswinefever，CSF)和豬繁殖與呼吸障礙綜合癥(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)是兩種常見的對豬危害性極大的傳染病，CSFV與PRRSV這兩種病毒感染引起豬的臨床癥狀有時很相似，并且臨床上還常常有CSFV和PRRSV混合感染的病例出現，共同的癥狀表現為體溫升高、急性死亡、懷孕母豬流產或死胎等，單靠臨床診斷很難作出判斷，需要借助實驗室才能進行確診。目前實驗室診斷這兩種病的方法常見的有病原分離鑒定、PCR方法、熒光定量PCR方法、ELISA方法、LAMP方法和GeXP方法等，但是這些方法都各有優點與缺點。病原分離鑒定耗時長、繁瑣，PCR方法需要電泳才能得結果，ELISA方法檢病原不夠敏感，熒光定量PCR方法和GeXP方法需要昂貴的儀器設備，單重LAMP方法只能檢一種病原體。
技術實現思路
本專利技術提供了一種檢測CSFV和PRRSV的引物組合物，該引物組合物包括2組特異性引物和探針，其中第一組特異性引物和探針包括CSFV-F3，CSFV-B3，CSFV-FIP，CSFV-BIP，以及CSFV-Probe，第二組特異性引物和探針包括PRRSV-F3，PRRSV-B3，PRRSV-FIP，PRRSV-BIP，以及PRRSV-probe，第一組和第二組特異性引物和探針依次為序列表中SEQIDNo.1至SEQIDNo.10所示核苷酸序列，或為將序列表中SEQIDNo.1至SEQIDNo.10所示的核苷酸序列經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與所述序列表中所示的核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；CSFV-probe的5’端標記FAM熒光基團，3’端標記BHQ1淬滅基團，該FAM熒光基團在520nm波長下呈綠色；所述PRRSV-probe的5’端標記CY5.5熒光基團，3’端標記BHQ2淬滅基團，該CY5.5熒光基團在690nm波長下呈紅色。本專利技術還提供一種檢測CSFV和PRRSV的試劑盒,該試劑盒包括前述的引物組合物。進一步的，該試劑盒中內引物CSFV-FIP、CSFV-BIP、PRRSV-FIP、PRRSV-BIP，外引物CSFV-F3、CSFV-B3、PRRSV-B3、PRRSV-F3和探針CSFV-Probe、PRRSV-Probe的濃度比為80：10：1。進一步的，本專利技術試劑盒的每25ul反應體系中包括模板RNA2μL，2×緩沖液12.5μL，Bst3.0DNA聚合酶320U，內引物CSFV-FIP、CSFV-BIP、PRRSV-FIP和PRRSV-BIP各40pmol，外引物CSFV-F3、CSFV-B3、PRRSV-B3和PRRSV-F3各5pmol，探針CSFV-Probe和PRRSV-Probe各0.5pmol，加雙蒸水補足至25μL；所述2×緩沖液成分為100mMKCl，200mMpH8.8的Tris–HCl，100mM(NH4)2SO4，80mMMgSO4，8Mbetaine，1％Tween-20，14mMdNTPs。本專利技術還提供一種檢測豬CSFV和PRRSV的方法，采用前述的引物組合物或試劑盒進行環介導等溫擴增反應。進一步的，環介導等溫擴增反應反應體系中內引物CSFV-FIP、CSFV-BIP、PRRSV-FIP、PRRSV-BIP，外引物CSFV-F3、CSFV-B3、PRRSV-B3、PRRSV-F3和探針CSFV-Probe、PRRSV-Probe的濃度比為80：10：1。進一步的，環介導等溫擴增反應的每25ul反應體系中包括模板RNA2μL，2×緩沖液12.5μL，Bst3.0DNA聚合酶320U，內引物CSFV-FIP、CSFV-BIP、PRRSV-FIP和PRRSV-BIP各40pmol，外引物CSFV-F3、CSFV-B3、PRRSV-B3和PRRSV-F3各5pmol，探針CSFV-Probe和PRRSV-Probe各0.5pmol，加雙蒸水補足至25μL；所述2×緩沖液成分為100mMKCl，200mMpH8.8的Tris–HCl，100mM(NH4)2SO4，80mMMgSO4，8Mbetaine，1％Tween-20，14mMdNTPs。進一步的，環介導等溫擴增反應的反應過程包括62℃反應90分鐘，85℃5分鐘。本專利技術還提供一種前述的檢測CSFV和PRRSV的引物組合物、檢測CSFV和PRRSV的試劑盒、檢測CSFV和PRRSV的方法在同時檢測豬瘟病和豬藍耳病中的應用。本專利技術的有益效果包括：采用本專利技術提供的檢測CSFV和PRRSV的引物組合物、試劑盒，檢測特異性好，敏感性較高，方便快捷，在熒光下直接通過反應產物顏色判斷結果，結果準確直觀，可用于臨床樣品的檢測，為臨床快速檢測區分CSFV和PRRSV提供了多一種選擇方法。本專利技術的二重LAMP，只需要2條外引物、2條內引物和1條帶熒光基團的環引物，而單重常規LAMP則需要六條引物包括2條外引物、2條內引物和2條環引物。本專利技術的環引物上帶有不同的發光熒光基團和淬滅基團，反應前熒光基團與淬滅基因緊密相鄰，此時探針中的熒光基團不發光，二重LAMP反應中，探針分子雜交到靶序列上，引物延伸，使探針斷裂，熒光基團與淬滅基團分開，熒光基團發光。結果通過不同的顏色一次能檢測鑒別2種病原體，且快捷。本專利技術采用Bst3.0DNA聚合酶進行二重熒光LAMP擴增，與采用Bst2.0DNA聚合酶和BstDNA聚合酶大片段的二重熒光LAMP相比，具有更佳的的延伸能力活性、更強的逆轉錄活性以及強烈的鏈置換活性。以本專利技術的引物組及用該酶組建的檢測試劑盒，一次加模板就能完成LAMP擴增，不需要預先對RNA模板單獨進行逆轉為cDNA，尤其是對DNA和RNA(或含有二級復雜結構的RNA)混合模板檢測特別方便。對有二級復雜結構的RNA模本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種檢測CSFV和PRRSV的引物組合物，其特征在于，所述引物組合物包括2組特異性引物和探針，其中第一組特異性引物和探針包括CSFV-F3，CSFV-B3，CSFV-FIP，CSFV-BIP，以及CSFV-Probe，第二組特異性引物和探針包括PRRSV-F3，PRRSV-B3，PRRSV-FIP，PRRSV-BIP，以及PRRSV-probe，所述第一組和第二組特異性引物和探針依次為序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示核苷酸序列，或為將所述序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示的核苷酸序列經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與所述序列表中所示的核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；所述CSFV-probe的5’端標記FAM熒光基團，3’端標記BHQ1淬滅基團，該FAM熒光基團在520nm波長下呈綠色；所述PRRSV-probe的5’端標記CY5.5熒光基團，3’端標記BHQ2淬滅基團，該CY5.5熒光基團在690nm波長下呈紅色。/n

【技術特征摘要】
1.一種檢測CSFV和PRRSV的引物組合物，其特征在于，所述引物組合物包括2組特異性引物和探針，其中第一組特異性引物和探針包括CSFV-F3，CSFV-B3，CSFV-FIP，CSFV-BIP，以及CSFV-Probe，第二組特異性引物和探針包括PRRSV-F3，PRRSV-B3，PRRSV-FIP，PRRSV-BIP，以及PRRSV-probe，所述第一組和第二組特異性引物和探針依次為序列表中SEQIDNo.1至SEQIDNo.10所示核苷酸序列，或為將所述序列表中SEQIDNo.1至SEQIDNo.10所示的核苷酸序列經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與所述序列表中所示的核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；所述CSFV-probe的5’端標記FAM熒光基團，3’端標記BHQ1淬滅基團，該FAM熒光基團在520nm波長下呈綠色；所述PRRSV-probe的5’端標記CY5.5熒光基團，3’端標記BHQ2淬滅基團，該CY5.5熒光基團在690nm波長下呈紅色。


2.一種檢測CSFV和PRRSV的試劑盒,其特征在于,所述試劑盒包括權利要求1所述的引物組合物。


3.根據權利要求2所述的檢測CSFV和PRRSV病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中內引物CSFV-FIP、CSFV-BIP、PRRSV-FIP、PRRSV-BIP，外引物CSFV-F3、CSFV-B3、PRRSV-B3、PRRSV-F3和探針CSFV-Probe、PRRSV-Probe的濃度比為80：10：1。


4.根據權利要求2或3所述的檢測CSFV和PRRSV的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的每25ul反應體系中包括模板RNA2μL，2×緩沖液12.5μL，Bst3.0DNA聚合酶320U，內引物CSFV-FIP、CSFV-BIP、PRRSV-FIP和PRRSV-BIP各40pmol，外引物CSFV-F3、CSFV-B3、PRRSV-B3和PRRSV-F3各5pmol，探針CSFV-Probe和PRRSV-Probe各0.5pmol，加...

【專利技術屬性】
技術研發人員：謝芝勛，謝志勤，張民秀，范晴，羅思思，謝麗基，黃嬌玲，王盛，曾婷婷，張艷芳，鄧顯文，
申請(專利權)人：廣西壯族自治區獸醫研究所，
類型：發明
國別省市：廣西;45