一種玉米醇溶蛋白降解酶的制備方法及其應用技術

本發(fā)明專利技術公開了一種玉米醇溶蛋白降解酶的制備方法及其應用，屬于分子生物學技術領域。本發(fā)明專利技術公開的一種玉米醇溶蛋白降解酶的制備方法，利用現代分子技術成功優(yōu)化了玉米醇溶蛋白降解酶的基因序列，構建了能夠在酵母體外表達玉米醇溶蛋白降解酶的表達載體pPICZαA?ZDP，利用該載體和畢赤酵母能夠制備玉米醇溶蛋白降解酶，進而為玉米醇溶蛋白降解酶在生產中的應用提供技術支撐。

【技術實現步驟摘要】
一種玉米醇溶蛋白降解酶的制備方法及其應用
本專利技術涉及分子生物學
，更具體的說是涉及一種玉米醇溶蛋白降解酶的制備方法及其應用。
技術介紹
玉米是目前反芻動物飼喂系統中精料的主要成分。淀粉約占玉米干物質的70％，是反芻動物的重要能量來源。反芻動物利用玉米淀粉的重要途徑是利用瘤胃微生物對其降解。然而，盡管瘤胃環(huán)境較為復雜，存在廣泛能夠降解淀粉的微生物，但淀粉瘤胃消化率往往低于60％，對于干粉碎玉米通常會低于50％，而我國反芻動物養(yǎng)殖體系中用的最多的恰恰就是干粉碎玉米。瘤胃淀粉消化率不足會抑制瘤胃微生物蛋白合成，進而降低動物的生產性能。因此，提高淀粉的瘤胃消化率是優(yōu)化淀粉能量供應和提高動物生產的重要舉措。影響玉米淀粉瘤胃消化率的因素包括玉米的種類、刈割時間、淀粉組成(直鏈、支鏈淀粉比例)、加工方式以及玉米醇溶蛋白含量等。其中，近年來關于玉米中玉米醇溶蛋白含量對反芻動物瘤胃淀粉降解影響的研究備受關注。玉米醇溶蛋白是玉米胚乳中的主要貯存蛋白質，與淀粉顆粒以交聯復合體的形式存在，不溶于水、低鹽溶液以及瘤胃環(huán)境，但可溶于60％～95％的乙醇溶液。玉米醇溶蛋白的瘤胃不溶特性決定了其在瘤胃中很難被微生物降解，進而限制瘤胃微生物與淀粉顆粒的接觸，導致淀粉降解性下降。研究顯示，玉米醇溶蛋白含量由7.6％增加至9.1％時，瘤胃淀粉有效降解率由61.9％降至46.2％。與此類似，在另外一個研究中，玉米醇溶蛋白含量由3.09％增加到6.04％，體外瘤胃淀粉降解率由62.1％降至52.9％，瘤胃有效降解率則由49.3％降至39.6％，回歸統計顯示，玉米醇溶蛋白與體外瘤胃淀粉降解率、瘤胃淀粉有效降解率均呈極顯著的負相關關系。綜上可知，玉米醇溶蛋白對玉米中淀粉的瘤胃消化起顯著的抑制作用，尋找降解玉米醇溶蛋白的有效措施，是提高瘤胃淀粉消化率的重要途徑。對于如何降解玉米中的玉米醇溶蛋白，目前主要采用對玉米進行加工處理、添加外源酶制劑等措施。對玉米籽粒進行蒸汽壓片、青貯發(fā)酵處理，可在一定程度上破壞或降解玉米醇溶蛋白，提高淀粉的瘤胃消化率，但存在能耗和成本較高的缺陷；而對玉米籽粒進行青貯發(fā)酵主要應用于高水分玉米，該措施不適用于我國當前的畜牧生產環(huán)境。一些工業(yè)領域嘗試利用堿性、中性、酸性蛋白酶、以及微生物發(fā)酵復合酶去降解玉米醇溶蛋白，但收效甚微，即使這些酶在最適作用條件下，對玉米醇溶蛋白的降解率也僅為15-33％，這主要是因為，選擇的酶在降解玉米醇溶蛋白方面缺乏專一性，這突顯出選擇玉米醇溶蛋白專一性降解酶的重要性。玉米種子在萌發(fā)過程中會動用貯存蛋白以提供胚芽生長所必須的營養(yǎng)物質。研究發(fā)現，玉米種子在萌發(fā)過程中會通過分泌的專一性玉米醇溶蛋白降解酶(zein-degradingprotease，ZDP)將貯存蛋白(含玉米醇溶蛋白)幾乎全部降解。但玉米種子在萌發(fā)過程中產生的蛋白成分復雜，且分泌的玉米醇溶蛋白降解酶濃度較低，分離純化較為困難，這阻礙了它在生產中的進一步應用。因此，提供一種玉米醇溶蛋白降解酶的制備方法及其應用是本領域技術人員亟需解決的問題。
技術實現思路
有鑒于此，本專利技術提供了一種玉米醇溶蛋白降解酶的制備方法及其應用。為了實現上述目的，本專利技術采用如下技術方案：一種玉米醇溶蛋白降解酶的制備方法，具體步驟如下：(1)優(yōu)化玉米醇溶蛋白降解酶基因；(2)構建重組表達載體pPICZαA-ZDP；(3)將重組表達載體pPICZαA-ZDP轉化畢赤酵母，獲得陽性克隆，進行培養(yǎng)；(4)將培養(yǎng)的菌液離心，獲得培養(yǎng)上清液；進行親和層析純化，獲得純化的玉米醇溶蛋白降解酶。進一步，步驟(1)根據畢赤酵母的密碼子偏好性和pPICZαA載體特點，對玉米醇溶蛋白降解酶基因進行優(yōu)化，優(yōu)化后的玉米醇溶蛋白降解酶基因為SEQIDNO.1。進一步，步驟(2)構建重組表達載體pPICZαA-ZDP的具體步驟如下：利用EcoRI和XbaI限制性內切酶分別對玉米醇溶蛋白降解酶基因片段和表達質粒pPICZαA進行雙酶切；膠回收玉米醇溶蛋白降解酶基因片段和pPICZαA質粒片段；取玉米醇溶蛋白降解酶目的片段4μl，T4連接酶和緩沖液5μl，純化的pPICZαA載體1μl混勻，16℃循環(huán)水浴孵育過夜；轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，于含Amp的LB培養(yǎng)基中篩選陽性克隆；挑取白色菌落加入到含Amp的液體LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩過夜培養(yǎng)，待培養(yǎng)基渾濁后，提取重組表達載體質粒pPICZαA-ZDP，并進行酶切驗證。進一步，步驟(3)轉化畢赤酵母的具體步驟如下：利用限制性內切酶SacI對重組表達載體pPICZαA-ZDP進行酶切，對酶切產物進行純化；純化的表達載體pPICZαA-ZDP轉入畢赤酵母X33感受態(tài)細胞，于含博來霉素的YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過PCR擴增反應篩選陽性克隆；挑取1個陽性克隆白色菌落加入到2mLYPD培養(yǎng)基中，30℃、160rpm震蕩過夜培養(yǎng)；將全部菌液轉入到200mLBMGY培養(yǎng)基中，30℃震蕩過夜培養(yǎng)，用于發(fā)酵罐培養(yǎng)。進一步，所述的玉米醇溶蛋白降解酶在水解玉米醇溶蛋白中的應用。進一步，所述的玉米醇溶蛋白降解酶在促進淀粉酶降解玉米淀粉中的應用。經由上述的技術方案可知，與現有技術相比，本專利技術公開提供了一種玉米醇溶蛋白降解酶的制備方法及其應用，利用現代分子技術成功優(yōu)化了玉米醇溶蛋白降解酶的基因序列，構建了能夠在酵母體外表達玉米醇溶蛋白降解酶的表達載體pPICZαA-ZDP，利用該載體和畢赤酵母能夠制備玉米醇溶蛋白降解酶，進而為玉米醇溶蛋白降解酶在生產中的應用提供技術支撐。附圖說明為了更清楚地說明本專利技術實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本專利技術的實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據提供的附圖獲得其他的附圖。圖1附圖為本專利技術重組玉米醇溶蛋白降解酶的SDS-PAGE和Westernblot分析；其中，泳道1、蛋白質marker；泳道2、純化的玉米醇溶蛋白降解酶SDS-PAGE分析；3、玉米醇溶蛋白降解酶的Westernblot分析；圖2附圖為本專利技術玉米醇溶蛋白降解酶的最適pH確定；圖3附圖為本專利技術玉米醇溶蛋白降解酶的最適溫度確定；圖4附圖為本專利技術玉米醇溶蛋白降解酶對商品玉米醇溶蛋白的降解；圖5附圖為本專利技術對照組干粉碎玉米的掃描電鏡圖；比例尺大小為20μm；圖6附圖為本專利技術玉米醇溶蛋白降解酶處理組干粉碎玉米的掃描電鏡圖；比例尺大小為20μm；圖7附圖為本專利技術玉米醇溶蛋白降解酶對干粉碎玉米的水解作用；圖8附圖為本專利技術玉米醇溶蛋白降解酶對淀粉酶降解玉米中淀粉的協同促進作用。具體實施方式下面將結合本專利技術實施例中的附圖，對本專利技術實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本專利技術一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒緦＠夹g中的實施本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種玉米醇溶蛋白降解酶的制備方法，其特征在于，具體步驟如下：/n(1)優(yōu)化玉米醇溶蛋白降解酶基因；/n(2)構建重組表達載體pPICZαA-ZDP；/n(3)將重組表達載體pPICZαA-ZDP轉化畢赤酵母，獲得陽性克隆，進行培養(yǎng)；/n(4)將培養(yǎng)的菌液離心，獲得培養(yǎng)上清液；進行親和層析純化，獲得純化的玉米醇溶蛋白降解酶。/n

【技術特征摘要】
1.一種玉米醇溶蛋白降解酶的制備方法，其特征在于，具體步驟如下：
(1)優(yōu)化玉米醇溶蛋白降解酶基因；
(2)構建重組表達載體pPICZαA-ZDP；
(3)將重組表達載體pPICZαA-ZDP轉化畢赤酵母，獲得陽性克隆，進行培養(yǎng)；
(4)將培養(yǎng)的菌液離心，獲得培養(yǎng)上清液；進行親和層析純化，獲得純化的玉米醇溶蛋白降解酶。


2.根據權利要求1所述的一種玉米醇溶蛋白降解酶的制備方法，其特征在于，步驟(1)根據畢赤酵母的密碼子偏好性和pPICZαA載體特點，對玉米醇溶蛋白降解酶基因進行優(yōu)化，優(yōu)化后的基因片段為SEQIDNO.1。


3.根據權利要求2所述的一種玉米醇溶蛋白降解酶的制備方法，其特征在于，步驟(2)構建重組表達載體pPICZαA-ZDP的具體步驟如下：利用EcoRI和XbaI限制性內切酶分別對玉米醇溶蛋白降解酶基因片段和表達質粒pPICZαA進行雙酶切；膠回收玉米醇溶蛋白降解酶基因片段和pPICZαA質粒片段；取玉米醇溶蛋白降解酶目的片段4μl，T4連接酶和緩沖液5μl，純化的pPICZαA載...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：趙向輝，劉嬋娟，瞿明仁，潘珂，李艷嬌，張文靜，楊竹青，
申請(專利權)人：江西農業(yè)大學，
類型：發(fā)明
國別省市：江西;36